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大 腸菌 培養を取ります。
培養物を新鮮な培地で希釈し、インキュベートして細菌の分裂を促進します。
次に、細菌分裂阻害剤を含む培地で培養物を希釈し、インキュベートします。
バクテリアは分裂することなく増殖し続け、細長いフィラメントを形成します。
培養物を新しいチューブに移し、遠心分離してフィラメントをペレット化し、上清を除去します。
スフェロプラス体の溶解を防ぐために、浸透圧安定剤でペレットを洗浄します。溶液を取り除きます。
バッファー、リゾチーム、DNase、キレート剤を順番に加えます。インキュベート。
キレート剤はフィラメントの外膜を不安定にします。
リゾチームは露出したペプチドグリカン層を分解し、フィラメントの形を崩し、スフェロプラストと呼ばれる球形構造を形成します。
さらに、DNase は、損傷したフィラメントから放出される汚染 DNA を分解します。
浸透圧安定剤を再度加え、混合し、インキュベートします。
懸濁液をバッファーと遠心分離機を含むチューブに移します。
余分な上清を除去し、スフェロプラストをバッファーに再懸濁して下流分析を行います。
一晩培養を設定するには、滅菌マイクロピペットチップを使用して、単一の細菌コロニーを固形寒天培養プレートから14ミリリットルの培養チューブに移し、2〜3ミリリットルの3%トリプチカーゼ大豆ブロス、TSBを含み、摂氏37度で16〜21時間インキュベートします。グラム陰性大 腸菌 スフェロプラストを調製するには、一晩培養物を1対100の比率で希釈し、250ミリリットルのフラスコに25ミリリットルのTSBを希釈し、細菌を振とうインキュベーターにさらに2.5時間戻します。溶液が600ナノメートルで0.5〜0.8の光学密度に達したら、新しい250ミリリットルフラスコで新鮮なTSBで培養物を1〜10の比率で希釈し、最終有効濃度60マイクログラムのセファレキシン。
光学顕微鏡で1000倍の倍率で可視化した長さ約50〜150マイクロメートルの単細胞フィラメントを製造すること。細菌溶液を遠心分離してフィラメントを回収し、上清をデカントします。ペレットを乱さないように注意しながら、1ミリリットルの0.8モルスクロースを穏やかに加えてフィラメントを洗浄します。
1分後、ペレットを乱さずに上清を廃棄し、指示された試薬をそれぞれの順序でフィラメントに加えます。室温で10分後、1ミリリットルの溶液Aを1分間かけて徐々に加え、溶液を手でそっと回転させます。溶液を室温で4分間インキュベートし、フィラメント懸濁液を7ミリリットルの摂氏4度溶液Bを含む2つの15ミリリットルの円錐形チューブの間に2つの等しいアリコートに分割します。次に、遠心分離によってフィラメントをペレット化し、血清学的ピペットを使用して、ペレットを乱すことなく、上清の1〜2ミリリットルを除くすべてを慎重に除去します。
p1000マイクロピペットを使用して、ペレットを穏やかに再懸濁します。光学顕微鏡でスフェロプラストの形成についてサンプルの小さなアリコートをチェックします。その後、スフェロプラストは摂氏マイナス20度で最大1週間、または3回の凍結融解サイクルを経るまで保存できます。