0 閲覧数 • 4:20 分 • September 26th, 2025
セルロース産生細菌を事前に接種した増殖培地を含むマルチウェルプレートから始めます。
処理されたウェルでは、培地に2-クロロエチルホスホン酸(CEPA)が添加されます。
ガス交換を防ぐためにプレートを密封し、インキュベートします。
インキュベーション中、CEPAはガス状分子であるエチレンを加水分解して放出します。
エチレンは細菌のセルロースシンターゼを活性化し、細胞質ゾルのUDP-グルコースを利用してセルロースを合成します。
時間が経つにつれて、細菌は膜を通してセルロースを押し出します。
これにより、気液界面での細菌の自己組織化が促進され、浮遊セルロースベースのバイオフィルム、つまりペリクルが形成されます。
インキュベーション後、ペリクルを新鮮なマルチウェルプレートに移します。アルカリ性溶液を加え、高温でインキュベートして細胞を溶解します。
アルカリ性溶液を取り除きます。セルロースを保持しながら細胞の破片を取り除くために、撹拌で繰り返し洗浄します。
ペリクルを乾燥させて重さを量ります。対照と比較してCEPA処理されたサンプルの乾燥重量が高いことは、エチレンに反応して細菌セルロース産生が増加していることを示しています。
ペリクルアッセイは、細菌セルロース製造の標準的な分析ツールです。PHと形態学的分析は、テキストプロトコルに詳述されています。調製では、スターター培養から細胞を3回収し、Petroff-Hauser計数チャンバーを使用して細胞を定量します。
次に、CEPA濃度の異なる4つのミディアムマスターミックスを調製します。各マスターミックスについて、60ミリリットルのpH 7 SH培地を分注し、120マイクロリットルの0、5、50、または500ミリモルのCEPAストック溶液を加えて、0、0.01、0.1、または1.0ミリモルの最終CEPA濃度を取得します。フラスコを回転させてこれらの媒体を混合します。
3 つの 1 つのメディア セットごとに 1 セット必要で、無菌コントロールとして機能するには 4 番目のセットが必要です。したがって、各60ミリリットルの培地製剤を4つの14ミリリットルのアリコートに分けます。次に、14ミリリットルのアリコートを予冷してから、それぞれのスターター培養物を接種して、最終濃度を1ミリリットルあたり100,000細胞にします。
セルロースの生成を防ぐために、接種したすべてのチューブを氷の上に保管してください。残りの14ミリリットルのアリコートは、無菌対照ウェルに使用します。次に、各14ミリリットルのマスターミックスから、2ミリリットルのアリコートを滅菌24ウェルプレートの6つのウェルにロードし、分析したスターター培養物ごとに合計4つのロードプレートをロードします。
プレートをパラフィンフィルムで慎重に密封し、摂氏30度で7日間静的にインキュベートします。プレートからペリクルを集めるには、ペリクルの片側を押し下げて反対側の端を持ち上げ、鉗子で持ち上げます。
次に、ペリクルを6ウェルプレートのウェルに個別に移します。12ミリリットルの0.1通常の水酸化ナトリウムを摂氏80度で20分間処理して細胞を溶解します。次に、水酸化ナトリウムを除去し、処理したペリクルを12ミリリットルの超純水で24時間完全に洗浄し、6ウェルプレートで撹拌して中和します。
このインキュベーション中は、6時間ごとに水を交換してください。インキュベーションが終わると、ペリクルは白くなるはずです。次に、ペリクルをシリコンマットの上に置き、摂氏50度で48時間乾燥させ、乾燥重量測定の準備をします。