細菌宿主における自殺プラスミドの増幅

バクテリアペレットから始めます。この細菌には、イニシエータータンパク質をコードする遺伝子が含まれていますが、抗生物質耐性遺伝子が欠けています。

細胞の分解を最小限に抑えるために、ペレットを冷水に再懸濁します。

抗生物質耐性遺伝子と標的遺伝子を運ぶプラスミドを取ります。このプラスミドは、イニシエータータンパク質なしでは複製できないため、自殺プラスミドと呼ばれます。

プラスミドを細菌懸濁液に加えます。

懸濁液を冷やしたキュベットに移します。

細菌膜を一時的に破壊する高電圧パルスを印加してエレクトロポレーションを開始し、プラスミドの侵入を可能にします。

回収培地を加え、混合物を培養チューブに移します。

振とうしながらインキュベートします。

抗生物質を含む寒天プレートを取り、培養物をプレートします。

細菌開始タンパク質は複製の起点に結合し、プラスミドが抗生物質耐性タンパク質を複製して発現できるようにします。

これにより、プラスミドを持つ細菌が生き残って増殖することができ、プラスミドの増幅が促進されます。

5, 000倍Gおよび4°Cで15分間遠心分離することにより、細菌培養物をペレット化します。ペレットを冷やした蒸留水に懸濁し、洗浄プロセスをさらに2回繰り返します。

細菌懸濁液をマイクロフリージチューブに移し、14, 000倍Gおよび摂氏4度で5分間遠心分離を繰り返す。ペレットを冷水に再懸濁した後、約3.5マイクロリットルのライゲーション混合物を加え、氷上で5分間インキュベートします。内容物を冷却した2ミリメートルギャップのエレクトロポレーションキュベットに移します。

エレクトロポレーション後、SOC培地を加え、内容物を培養チューブに移します。摂氏30度で200RPMで振とうしながら1時間インキュベートします。形質転換された細胞をクロラムフェニコールを添加したLB寒天プレートにプレーティングします。