ゲノムトランスポゾン挿入によるグラム陰性菌の単離

交配したドナーとレシピエントのグラム陰性菌集団の凍結培養物を氷上で解凍することから始めます。

レシピエント細胞は、抗生物質カナマイシンの耐性遺伝子を含む短いDNAセグメントであるトランスポゾンを運びます。これらのトランスポゾンは、宿主ゲノムにランダムに組み込まれます。

カナマイシンを含むがドナー固有の栄養素を含まない栄養豊富な寒天プレートに培養物を加えます。

滅菌ビーズを加え、プレートをゆっくりと回転させて培養物を均一に広げます。

ビーズを取り除き、インキュベートします。レシピエント細菌は栄養素を利用しますが、トランスポゾンが組み込まれた細菌のみがカナマイシンに抵抗し、コロニー形成につながります。

トランスポゾンのないドナーとレシピエントの細菌は増殖しません。

コロニー形成単位をカウントして、固有のトランスポゾン挿入を持つレシピエント細菌の数を推定します。

新鮮な培地を追加し、細菌集団を収集します。

遠心分離して細菌をペレット化し、上清を廃棄します。

細菌の生存率を維持するために、凍結保護剤を含む培地にペレットを再懸濁します。

氷上で凍結交尾のアリコートを解凍します。次に、滅菌ガラスビーズを使用して、150マイクロリットルの希釈液を、カナマイシンを添加した30 x 150ミリメートルのルリアベルタニ寒天プレートに広げます。

余分な交配を含む使用済みチューブを廃棄し、プレートを摂氏37度で14時間インキュベートします。インキュベーション後、各プレート上のコロニー形成ユニットをカウントして、トランスポゾンライブラリ内の総変異体を推定します。少なくとも3つのプレートの20%をカウントして、プレートのグループ全体のコロニーカウントの推定値を決定します。

推定コロニー収量を計算した後、各プレートに3〜5ミリリットルのLBを加え、滅菌スクレイピングツールを使用して細菌をこすり落とします。すべてのプレートから細菌懸濁液を50ミリリットルの円錐形チューブに引き込み、5, 000倍Gで7分間遠心分離して懸濁液をペレット化します。上清を廃棄し、ペレットを5ミリリットルのLBに再懸濁し、30%グリセロールを添加します。

次に、トランスポゾンライブラリーの1ミリリットルのアリコートをクライオバイアルで作り、マイナス80°Cで保存します。