C.エレガンスノックダウンをスクリーニングするためのマルチウェル液体ベースのアッセイ

C.エレガンス遺伝子を標的とする遺伝子特異的インサートの有無にかかわらず、RNAi細菌で事前にスポットされた寒天培地を含むマルチウェルプレートを取ります。

同期したL1期のワームをウェルに播種し、インキュベートしてRNAi細菌を食べられるようにしました。

インサートは、特定のワーム遺伝子を標的とする干渉RNAを生成し、遺伝子特異的なノックダウン表現型を生成します。

ウェルにバッファーを追加し、ワームを穏やかに再懸濁します。

懸濁液をディープウェルプレートに移し、ワームが重力によって沈降するのを待ちます。

バッファーを保持して上清を取り除きます。

ワームをバッファーで洗浄し、上清を廃棄し、少量のバッファーを残します。

次に、病原菌を含むマルチウェルアッセイプレートを取ります。

定義された数のコントロールワームとノックダウンワームをそれぞれのウェルに分注して、宿主と病原体の相互作用を可能にします。病原菌は、ワームの死亡率を誘発する化合物を分泌します。

ワームの死亡率を比較して、ワームの生存に対する遺伝子特異的ノックダウンの影響を評価します。

ウェルあたり300匹のワームを含む24ウェルプレートのウェルあたり1ミリリットルのS基礎を追加します。プレートを振ってワームを穏やかに撹拌し、ワームを空の滅菌済みの24ディープウェルプレートに移します。

ワームが重力によって約5分間落ち着くのを待ちます。上清を吸引し、ウェルあたり約1ミリリットルを残し、次に各ウェルに7ミリリットルのS基礎を加えます。さらに2回洗浄を繰り返し、最後の洗浄後に約400マイクロリットルの上清を除くすべての上清を吸引します。

飢餓を避けるために細菌を384ウェルプレートにピペッティングした後、ワームソーターのリサンプラー機能を使用して、22匹のワームを384ウェルプレートの各ウェルに選別します。最後に、選別に続いて、小分子またはその他の実験固有の材料を追加します。