JoVE 実験百科事典
微生物学
0 回視聴 • 3:57 分 • September 26th, 2025
寒天で培養した病原菌から始めます。
細菌をこすり落とし、緩衝液に懸濁し、培地を加えて細菌の生存率を維持します。
懸濁液をマイクロプレートに分注します。
次に、病原体に対する感受性が高まったか、耐性が強化されたC .エレガンスの 幼虫の別々の株を取り、それらを定住させます。
上清を取り除き、幼虫を新鮮な培地に再懸濁し、細菌を含むマイクロプレートに移します。
マイクロプレートをガス透過性膜で密封し、インキュベートします。細菌は、ストレス経路を活性化し、細胞死を引き起こす有毒な代謝産物を分泌します。
ウェルを洗浄して細菌を除去し、細胞不透過性蛍光色素を加えてインキュベートします。
色素は、膜が破壊された死んだ幼虫細胞のみに浸透し、それらの核酸に結合します。
洗浄して余分な色素を除去し、蛍光染色されたワームを画像化して、感受性株と耐性株の死亡率を評価します。
液体キリングアッセイを実行するには、細胞スクレーパーを使用して緑 膿菌 をSKプレートから除去し、細菌を約5ミリリットルのS Basalに再懸濁します。
分光光度計を使用して、細菌懸濁液のOD 600を測定します。24ミリリットルの希釈した緑 膿菌 の希釈ストックをOD 600でS Basalに0.09に等しい調製し、次に21ミリリットルの液体SK培地を加え、マルチチャンネルピペットを使用して、45マイクロリットルの細菌と培地を384ウェルプレートの各ウェルに移します。ワームを発生源から50ミリリットルの円錐形のチューブに洗浄し、重力で沈降させます。
上清を5ミリリットルに吸引し、次に合計50ミリリットルのS基礎を使用してワームを再懸濁し、さらに2回洗浄を繰り返します。ワームソーターを使用して、テキストプロトコルに従って、約22匹のワームを384ウェルプレートの各ウェルに選別し、ガス透過性フィルムを使用してプレートを密封し、摂氏25度で24〜48時間インキュベートします。お好みの時間に、マイクロプレートウォッシャーとS Basalを使用して、384ウェルプレートを合計5回洗浄します。
最も犯しやすい間違いの1つは、ワームが完全に落ち着く前に384ウェルプレートを吸引することです。ワームが完全に落ち着いたかどうかを正確に確認するには、練習が必要です。最終洗浄後、上清を20マイクロリットルまで吸引します。
次に、ウェルあたり50マイクロリットルの0.98マイクロモル核酸染色剤を加え、最終濃度を0.7マイクロモルにします。プレートを室温で12〜16時間インキュベートします。所望のインキュベーション期間の後、マイクロプレート洗浄機を使用してプレートを最低3回洗浄します。
データ取得には、分光光度計または自動顕微鏡を使用して、透過光と蛍光の両方を画像化します。