プレーティングアッセイとフローサイトメトリーを使用した 大腸菌 における抗生物質誘発性フィラメンテーションの評価

抗生物質で前処理された 大腸菌 培養物から始めます。

この抗生物質は細胞分裂をブロックし、その結果、DNA 含有量が増加した細長い糸状細胞が形成されます。

培養物の一部を栄養豊富な寒天プレートにプレートし、インキュベートします。

糸状細胞は成長が続いているにもかかわらず分裂しません。非糸状細胞のみがコロニーを形成するため、コロニー数が少なくなります。

残りの細菌培養物を希釈し、蛍光DNA結合色素を加えます。その後、暗闇の中でインキュベートします。

色素は細胞に入り、DNAに結合します。

サンプルをボルテックスし、フローサイトメーターに通します。

各セルからの散乱光の量は、そのサイズに対応します。

同様に、色素結合核酸から発せられる蛍光は、細菌のDNA含有量を示します。

抗生物質で処理された細胞は、散乱と蛍光の増加を示し、糸状の成長と分裂のない継続的なDNA複製を反映しています。

これは、細胞分裂を阻害する抗生物質によって引き起こされる細菌の生理学の変化を示しています。

新鮮な培地で200マイクロリットルの培養サンプルの10倍からマイナス7分の1までの10倍の連続希釈液を調製します。

非常に穏やかなボルテックスまたはチューブを反転させることによって、各希釈液を混合します。選択されていないLBアガロースプレートに100マイクロリットルの適切な希釈液をプレートし、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、コロニーの数を数えて、各培養サンプル中の生細胞の濃度を決定します。

未処理および処理された細胞培養の時間の関数として、ミリリットルあたりのCFUをプロットします。分光光度計で培養物のOD 600を測定します。培養サンプルを摂氏4度の新鮮な培地で希釈して、OD 600のサンプルを0.06で得て、マイクロリットルあたり約15,000個の細胞に相当します。

DNA染色の場合は、希釈した細菌サンプルを1ミリリットルあたり10マイクログラムのDNA蛍光色素溶液と1対1の体積比で混合し、暗所で15分間インキュベートします。サンプルを注入する前に、非常に穏やかなボルテックスまたはチューブを反転させてサンプルを混合します。サンプルを毎分約120,000細胞の流速でフローサイトメーターに通します。

前方散乱光、側面散乱光、DNA蛍光色素/蛍光シグナルを適切な設定で取得します。