細菌の胞子発芽中の皮質分解の比色検出

細菌の胞子は、糖とアミノ酸のポリマーであるペプチドグリカン皮質層のために休眠状態のままです。

発芽中、皮質は分解して周囲の培地に糖を放出します。

皮質の分解を検出するには、胞子発芽中の定義された時点で収集された放出糖を含む培地から始めます。

参考までに、砂糖標準の濃度を上げて使用してください。

標準試料とサンプルは、糖を反応性形態に変換するために事前処理を受けました。

糖と反応して紫色の複合体を形成する比色検出試薬であるエールリッヒ試薬でインキュベートします。

混合物をマルチウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーを使用して着色複合体の吸光度を測定します。

吸光度は紫色の強度に対応し、糖濃度に正比例します。

時点サンプル全体の吸光度の増加は、進行性の皮質の劣化を示しています。

標準濃度からグラフを生成し、サンプル濃度を定量します。

サンプルを氷上に置いている間に、カラー試薬を準備します。0.320グラムのDMABを1.9ミリリットルの氷酢酸に溶かします。この試薬は時間、温度、光に敏感であるため、事前に作成しないでください。

DMABが完全に溶解したら、100マイクロリットルの通常の塩酸10を加え、サンプルをボルテックスします。次に、5ミリリットルの氷酢酸を加え、再びボルテックスします。比色反応では、冷却された各皮質または対照サンプルの100マイクロリットルを新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。

各サンプルに700マイクロリットルの新しく調製した着色液を加えます。すぐにサンプルを摂氏37度のウォーターバスに移し、サンプルを正確に20分間インキュベートします。インキュベーション後、各サンプル200マイクロリットルを透明な96ウェルプレートに移します。

サンプルは最初は黄色である必要がありますが、皮質の存在を示す還元糖が存在する場合は紫色に変化します。ここでは、多くのサンプルが目に見える紫色を示していません。ただし、250、500、および5,000ナノモルのサンプルは、ネガティブコントロールのゼロナノモルとは視覚的に異なって見えます。

プレートリーダーを使用して、585ナノメートルでの吸光度を測定します。外径585ナノメートルで測定した場合、標準サンプルから生成された信号は線形回帰に最も適合します。