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小胞形成を促進する短いペプチドである小胞核化ペプチド(VNp)でタグ付けされた組換えタンパク質をコードする細菌種の培養から始めます。
培養物に誘導剤を加えてインキュベートします。誘導剤はタンパク質発現を引き起こします。
VNpは内膜に埋め込まれ、膜の曲率を促進し、VNpタグ付きタンパク質を出芽小胞にカプセル化します。
小胞に富む培地をチューブに移します。遠心分離して、小胞に富む上清を分離します。
次に、上清をろ過して残留汚染物質を除去します。
次に、濾液を別の膜フィルターに通して、膜表面の小胞を捕捉します。
メンブレンを皿に入れ、リン酸緩衝生理食塩水を加えます。
小胞をそっと切り離し、懸濁液を清潔なチューブに移します。
懸濁液を超音波処理して小胞膜を破壊し、タンパク質を放出します。
ライセートを遠心分離して膜断片を分離します。
得られた上清には、分析の準備ができている精製された組換えタンパク質が含まれています。
IPTGを最大20マイクログラム/ミリリットル、または84マイクロモルの最終濃度に添加することにより、T7プロモーターから組換えタンパク質発現を誘導します。誘導に十分な時間を確保した後、3000 gおよび4°Cで20分間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を滅菌・洗剤不使用の0.45ミクロンのPESフィルターに通し、長期保存のために小胞を含む培地を滅菌します。
小胞をより小さな体積に濃縮するには、培地を含む滅菌小胞を滅菌および界面活性剤を含まない0.1ミクロンのMCEフィルターに通します。次に、0.5〜1ミリリットルの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でメンブレンを優しく洗浄し、セルスクレーパーまたはプラスチックスプレッダーを使用してメンブレンから小胞を慎重に取り除きます。ピペットを使用して、小胞濃縮物を新しい微量遠心チューブに移します。
精製された小胞は摂氏4度で保存できます。適切なスケジュールを使用して、滅菌培地中の小胞を含むタンパク質を超音波処理し、小胞脂質膜を破壊し、タンパク質を放出します。超音波処理された懸濁液を39,000 gおよび摂氏4度で20分間遠心分離して、小胞の破片を除去します。