Name: の巨大線維経路からの電気生理学的記録 D.キイロ /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: 学ぶDrosophila melanogasterの巨大線維系におけるシナプス伝達の電気生理学的記録法。DLMとTTM筋からの興奮性シナプス後電位を測定し、神経回路の機能特性を評価する手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、LPにウェルカムトラスト助成金によって支えられて

1。機器と材料<ol><li>これらの実験は、刺激、刺激分離ユニット、二つの微小電極増幅器、データ収集システムおよびコレクションのソフトウェアを備えたコンピュータで構成される標準的な電気生理学のセットアップを使用してください。追加の機器は、ファラデーケージ、ブームスタンドに実体顕微鏡、除振テーブル、光源、および記録のプラットフォームが含まれています。 </li><li>五マイクロマニピュレータが使用されます。他の3つのマイクロマニピュレータは2つだけ刺激電極と接地電極を配置するグロスコントロールを必要としながら二つのマイクロマニピュレーターは、記録電極を位置決めするための細かいコントロールを必要とする。 DLMの記録電極のためのマニピュレータは、準備の末尾に置かれます（実験者の左）とTTM記録電極のためのマニピュレータは、準備の実験と側面（やや実験者の左側にある）の間に配置されます。シミュレーションの電極を保持する2つのマイクロマニピュレーターは、準備の頭部（実験者の右側）に配置されます。接地電極用マイクロマニピュレータは、準備の遠い側に配置されています</li><li> MΩ40から60の抵抗とガラスの記録電極を引いて、ワックスでサポートされている皿に平らに保存。刺激には、2つの電解（NaOH）をシャープにタングステン電極が使用されます。タングステン線、またはサード電解作製電極は接地として使用されます。刺激と接地電極が準備され、マイクロマニピュレータに取り付けられ、実験セッションの開始前とセッションの期間中に交換する必要はない。 </li></ol> 2。 D.の準備キイロ <ol><li>お使いの機器が設定されたら、それはハエを準備する時間です。その上に氷を冷却することにより、またはCO 2を使用して、ハエを麻酔。 CO 2が使用されている場合には、ガスの影響のための十分な時間が（20分程度）の実験を開始する前に脱ぎ履きすることができます。 </li><li>約45 °の角度で傾斜ソフトワックスのプラットフォームを含む皿に自分の足でゆっくりとハエを転送するために鉗子を使用してください。次の4つのステップは、（ただし、これらに近い）の録音機器から離れて解剖顕微鏡下で行われます。 </li><li>次のステップは、ワックスでハエを確保することです。オリエントは、斜面上で、その前方に面した上にして、腹側を下に飛ぶ。細かいピンセットを使って、ペアで、足を外側に拡張し、ワックスにそれらを押してください。 </li><li>背縦走筋、またはDLM、およびtergotrochanteral筋肉、またはTTM：から記録される筋肉の位置を把握しておきましょう。 DLMSの表皮下の結合部位は、胸部正中線と前背側（または剛毛）毛の間の領域に対応しています。 TTMの付着部位は上記、鼻翼が剛毛後部と前部の背側に位置しています。ワックスにして、翼がDLMまたはTTM繊維へのアクセスを妨害しないことを確認して外側の翼を持ち、"接着剤"。 </li><li>鉗子の罰金ペアを使用して、外側に慎重に口吻を引いて、そしてワックスにそれを浸漬することによってそれを固定します。これは、口吻が柔らかく、簡単にヘッドの他の部分から切り離されているので、いくつかの練習を必要とする重要なステップです。その場合、フライを破棄して最初からやり直す。目を通して刺激電極を挿入するときにこの方法で頭を保護するために障害が問題につながります。 </li></ol> 3。電極を配置<ol><li>フライがワックスに固定されると、ファラデーケージ内部に配置されている実体顕微鏡の下に接続されたフライで皿を転送する。オリエントは、実験者の右にハエの頭で横飛び。 </li><li>次のステップは、電極を挿入することです。地面と刺激電極を顕微鏡で見ることなく挿入することができます。良い記録が正確な串刺しの刑に依存している、それはマニピュレーターを扱う練習する良いアイデアですので。それらの適切な配置とそれに続くレコーディングを容易にするためにマイクロマニピュレータの助けを借りて、挿入部位の近くに電極をもたらす。 </li><li>マイクロマニピュレータの調整ホイールを使って腹部の後端に接地電極を下ろします。脳内で鋭利なタングステン刺激電極を配置するには、それだけでハエの目の一つに触れるように一方の電極の先端の位置をマイクロマニピュレーターを使用してください。両電極は、単にそれぞれの目の外側に触れているので、他のと同じ操作を行います。その後、電極を押し、順番に、それぞれの目を通して、電極の先端が頭部カプセルの背面（2〜3ミリメートル程度）に位置する脳に達するので。 </li><li>正しく配置された電極は、ジャイアントファイバーシステムがアクティブになります。刺激電極が正しく配置されていることをテストするには、30から60までの短い（0.03ミリ）の刺激を適用する刺激電極、および飛行/脚部筋肉の翼とけいれんの動きのための外観全体のV' </li><li>次のステップは、ハミルトンや熱引っ張らプラスチックシリンジを使用して3M KClをガラス微小電極を埋戻し、及び微制御マニピュレーターにそれらを置くことです。適切に挿入された微小電極は、実験のいくつかのラウンドに使用することができます。 </li><li>最初の記録電極は、DLMの繊維に挿入されます。 two左右対称DLMSがありますが、それぞれは6つの個々の筋線維で構成されています。録音は、6つの繊維のいずれかから行うことができますが、最も一般的に使用さDLM繊維胸部キューティクルの背側を介してそれらの良好なアクセス性のために45aと45bは、両方の繊維が同じmotorneuronによって支配されているという事実である。 </li><li>お客様から最も遠い側にマイクロマニピュレーターを用いて、DLM繊維45Aまたはbに記録電極を挿入するプラットフォームの傾斜は、DLM電極の浸透を助ける〜60から90 °の角度、で背側クチクラを入力することができます。オシロスコープモードでソフトウェアを使用し、胸部に記録電極を挿入しながら、コンピュータのモニターを見ながら行ってください。電極は、筋肉を入力したときのベースラインはほぼゼロまたは負の値に低下します。あなたが筋肉の反応を観察できるかどうかを確認するために、単一の刺激とテスト。 </li><li>あなたに一番近いTTMに他の記録電極を挿入します。この電極は、筋肉の付着部位の位置のために、あなたの前に、横方向に挿入されます。トレースは、電極が筋肉であることを示すと、単一の刺激でこれとテストをしながら、もう一度モニターを観察。 </li></ol> 4。刺激と記録<ol><li>これで、脚と飛翔筋から脳と記録の応答を刺激開始する準備が整いました。 30 Vから始まると（コンピュータのモニタ上で観察されるように、すなわち筋収縮、および筋細胞の脱分極）が応答を観測するまで、60 Vに増加させる刺激電極間のショート（0.03ミリ）刺激を適用します。実験の残りの部分では、応答の閾値以上の電圧が50から10 Vに設定します。 </li><li>応答の遅延を測定するには、各刺激の間に5秒間の残りの期間で、少なくとも5つの刺激を与える。 </li><li>異なるレートで刺激の列車を提供することにより、"以下の周波数を"決定する。通常10刺激の10列車は、200Hzの（各刺激の間に5msの）と300Hzのは、（各刺激の間に3msの）、100Hzの（各刺激の間に10msの）で与えられる。刺激の各列車の間に2秒の休止期間を許可する。 </li></ol> 5。結果：ジャイアント線維経路で、次の応答のレイテンシと周波数<ol><li>応答待ち時間は、脳の刺激と筋肉の脱分極までの時間です。この図は、単一刺激にDLMとTTMの応答待ち時間を比較します。 0.7 GF - DLM経路用GF - TTM経路用と1.3と1.7ミリから1.2ミリ秒の間のレイテンシは、健全な準備と適切な録音のテクニックを示している。待ち時間は、遺伝子型、遺伝的背景、温度と加齢とともに変化することができます。 図1（AおよびB）。脳に適用される単一の刺激に続くTTMSとDLMSから記録された応答を示す代表的なトレース。 </li><li>ここに示されているように、TTMからの録音は、振幅と大きなDLM繊維からのものに比べてシナプス後電位（PSP）の形状の面でより多くの変動を示し、この増加の変動は、TTM筋線維のサイズが小さいためです。この可変性は、しかし、巨大なファイバーツーTTM経路の応答の待ち時間の値には影響しません。 図1（CおよびD）。TTMとDLMの両方のための4つの個別ハエからさらに"応答の待ち時間"のトレース。 TTMのトレースは、PSPの形状の変動を示すが、応答の遅延は影響を受けませんされます。 DLMのためにPSPの形状にあまりばらつきがある。 <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig1.jpg" alt="図1 A-D" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1 - D"> </li><li>各刺激の周波数でのDLMとTTMの経路の両方に成功応答（10点満点）の割合を計算することによって100 Hz、200 Hzの、300 Hzで、"以下の周波数を"比較。 100 Hzで、TTMとDLMの両方が刺激1:1に従ってください。 100 Hzの上記の刺激の周波数では、DLMの応答は、2つの介在ニューロンの間の仲介の化学シナプスは、刺激間で回復するのに十分な時間がないため、障害の表示を開始します。 TTMの応答は、しかし、さらに300Hzのを超えて刺激と1:1のままである。 図2の録音を"以下の周波数"を示す代表的なトレース。 100Hzで、TTMSとDLMS両方がすべての10の刺激（左）に対応。 200Hzの時に、DLM応答は（アスタリスク）が失敗し始めます。 <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> </li></ol>6。代表的な結果野生型短潜時応答は、（刺激電極が目に配置され、感覚受容器をバイパスし、直接GF回路が作動）遺伝子型、遺伝的背景、温度、年齢、およびGF - TTMの経路は0.7と1.2ミリ秒の間の範囲に依存し、 GF - DLM経路1.3 and1.7ミリ秒（Tanouyeとワイマン、1980;トーマスとワイマン、1984年、エンゲルと呉、1992;アレンやマーフィー、2007;フェランら、2008;。オーギュら 、未発表。） 。この非常に短いTTMの待ち時間は単シナプス経路の堅牢なGF - TTMn電気シナプスによるもので、長くDLM待ち時間が原因経路のdisynaptic性質だけでなく、化学シナプス（PSI - DLMn）の存在が原因で発生します。 GFの求心性神経の活性化と低強度の刺激を使用するか、視覚的な（"ライトオフ"）信号を提供することによって、どちらかが達成されているから中間とレイテンシの長い応答（&gt; 3ミリ秒）の結果。 100HzでTTMとDLMの両方が刺激1:1に従ってください。 100HzのDLMの応答の上にPSIとDLMnsの間の化学シナプスが離れて10ミリ秒未満の刺激の間に回復するために十分な時間を持っていないので、障害を表示するために開始されます。 TTMの応答は、しかし、さらに300Hzの（;エンゲルと呉、1992;。Allenら、2007;。マルティネスら 、2007 Tanouyeとワイマン、1980）を超えて刺激と1:1のままになります。 GF - DLMのブランチの応答がない間、 ショウジョウバエのギャップジャンクションチャネル（"innexinを"）をコードするshakB遺伝子の突然変異は、、大幅にGF - TTM経路（〜1.5ミリ秒）の応答の待ち時間が増加（アレンやマーフィー、2007;フェランら 、2008）。変異体の応答が遅延効果が中断神経筋伝達によるものではないことを示す、直接胸神経節を刺激することによって復元することができます。高い周波数の刺激に従う能力はまた、野生型GF - DLMとGF - TTM経路は通常、それぞれ100 Hzと300 Hzの、1:1の比率で10刺激をフォローアップすることができる場所飛ぶと比較して、これらの変異体では低下している。これらの周波数はかなり持続飛行時の収縮筋（3-10 Hz）の（Hummonとコステロ、1989）によって受信された正常な刺激の周波数を超えていることに注意する必要があります。 GFSの出力の安定性を記述するために使用される別のパラメータには、"不応期"、または、まだ筋肉から2つの応答を生成するツイン刺激パルス間の最小時間です。耐火時間はTTMS 1-4の間にmsおよびDLMSのための7から15ミリ秒を変化させます。 Gorczycaとホール、1984; DLMSのための比較的長い不応期が比較的PSI - DLMnジャンクション（Tanouyeとワイマン、1980での化学シナプスを不安定なことになっているエンゲルと呉、1992;。Banerjeeさんら 、2004;アレンとGodenschwege、 2010）。

<ol><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. Electrophysiological Recordings from the Drosophila Giant Fiber System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllen%2C+MJ+%22Drosophila+Neurobiology%3A+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila Neurobiology: A Laboratory Manual</a>. Zhang, B., Freeman, M. R., Wadde, S. , 1st Lab ed, Cold Spring Harbor Press. (2010).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+an+escape%3A+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17, 31-41 (2006).</li>
<li>Allen, M. J., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+component+of+the+mixed+GF-TTMn+synapse+in+Drosophila+melanogaster+uses+acetylcholine+as+its+neurotransmitter%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter.</a> Eur J Neurosci. 26, 439-445 (2007).</li>
<li>Banerjee, S., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+flight+and+associated+neuronal+rhythmicity+in+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of flight and associated neuronal rhythmicity in inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mutants of Drosophila.</a> J Neurosci. 24, 7869-7878 (2004).</li>
<li>Engel, J. E., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+membrane+excitability+mutations+affecting+potassium+and+sodium+currents+in+the+flight+and+giant+fiber+escape+systems+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Interactions of membrane excitability mutations affecting potassium and sodium currents in the flight and giant fiber escape systems of Drosophila.</a> J Comp Physiol A. 171, 93-104 (1992).</li>
<li>Gorczyca, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cholinergic+synapse+in+the+giant+fiber+pathway+of+Drosophila+using+conditional+mutations+of+acetylcholine+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis.</a> J Neurogenet. 1, 289-313 (1984).</li>
<li>Hummon, M. R., Costello, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+fiber+activation+of+flight+muscles+in+Drosophila%3A+asynchrony+in+latency+of+wing+depressor+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Giant fiber activation of flight muscles in Drosophila: asynchrony in latency of wing depressor fibers.</a> J Neurobiol. 20, 593-602 (1989).</li>
<li>Jacobs, K., Todman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+in+the+giant-fibre+system+of+Drosophila%3A+interaction+of+the+giant+fibre+and+its+major+motorneuronal+target%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis in the giant-fibre system of Drosophila: interaction of the giant fibre and its major motorneuronal target.</a> Development. 127, 5203-5212 (2000).</li>
<li>King, D. G., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+giant+fibre+pathway+in+Drosophila.+I.+Three+thoracic+components+of+the+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the giant fibre pathway in Drosophila. I. Three thoracic components of the pathway.</a> J Neurocytol. 9, 753-770 (1980).</li>
<li>Martinez, V. G., Javadi, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+climbing+behavior+and+neural+circuit+physiology+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in climbing behavior and neural circuit physiology in Drosophila.</a> Dev Neurobiol. 67, 778-791 (2007).</li>
<li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , 2nd, Hafner. New York. 502-503 (1965).</li>
<li>Phelan, P., Goulding, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+rectification+at+identified+electrical+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of rectification at identified electrical synapses in the Drosophila giant fiber system.</a> Curr Biol. 18, 1955-1960 (2008).</li>
<li>Power, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thoracico-abdominal+nervous+system+of+an+adult+insect%2C+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect, Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 88, 347-409 (1948).</li>
<li>Tanouye, M. A., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+outputs+of+giant+nerve+fiber+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila.</a> J Neurophysiol. 44, 405-421 (1980).</li>
<li>Thomas, J. B., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+altering+synaptic+connectivity+between+identified+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila.</a> J Neurosci. 4, 530-538 (1984).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

いずれかの高品質の録音を取得しようとしたときに注意を払わなければならない最も重要なことの一つは、準備の適切な方向と健康です。理想的には、ハエはまだレコーディングセッションの終了時に生きていると電気刺激に応答してください。記録電極は、最も効率的に胸部外骨格を浸透させるには、フライは、電極と直角を形成するような方法で表面に接着する必要がある、必要な場合は、電極の挿入はの部分を除去することによって促進することができます。 DLM飛翔筋を（このステップは、ガラス電極の先端が破損することが困難にするという追加の利点を提供しています）公開するため、メスタングステンと背側胸部キューティクル。また、介護がsubcuticularlyあるDLMSとTTMS介して電極を押ししないように注意する必要があります。ハエの頭がよく適切に脳内に挿入される刺激電極を可能にするために、それらは、記録セッション中に引き出されるのを防ぐためにセキュリティで保護する必要があります。 その大きさとよく説明した形態に起因する、GFSは、 ショウジョウバエで最もアクセス神経経路のいずれかを表します。小さ ​​な分子量のトレーサーの染料に電気シナプスの透過性は、電気的に結合ニューロンの可視化を可能にし、いくつかの利用可能なGAL4ラインは、セルまたはセルのグループ（Jacobs ら 、2000のサブセットの遺伝子発現レベルを操作することが可能に。。アレンら 、2006） ショウジョウバエ GFS神経可塑性を研究するための便利なモデルシステム（エンゲルと呉作る上記の利点が、そのような習慣性、自然回復と脱馴化などの回路の表示プロパティの両方求心性と胸部のコンポーネントに加えて、 1996年）。

<table border="1"><tbody><tr><td> NAME </td><td> COMPANY </td><td> CAT。 ＃ </td><td> コメント </td></tr><tr><td> S48スクエアパルス刺激</td><td>グラスの楽器</td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td>刺激ユニット</td><td>グラスの楽器</td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> SIU5 RFトランスのアイソレーションユニット</td><td>グラスの楽器</td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> 5A 2チャネル細胞内微小電極増幅器</td><td>楽器を入手する</td><td></td><td> http://www.gettinginstruments.com/ </td></tr><tr><td> Digidata 1440Aデータ収集システム</td><td>分子デバイス</td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td>アナログ - デジタルDigidata 1320とAxoscope 9.0ソフトウェア</td><td>分子デバイス</td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td>手動マニピュレーターとレコーディングプラットフォーム</td><td>成茂、サターイン。、世界の精密イン。 </td><td></td><td> http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td>光源</td><td> Fostec </td><td></td><td> http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm </td></tr><tr><td>ワイルドM5の実体顕微鏡</td><td>ワイルドHeerbrugg </td><td></td><td> http://www.wild-heerbrugg.com/ </td></tr><tr><td>防振テーブル</td><td> TMC </td><td></td><td> http://www.techmfg.com/ </td></tr><tr><td>微小電極用ホウケイ酸塩チューブ</td><td>サターのインストゥルメント</td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> P - 95マイクロピペットプラー</td><td>サターのインストゥルメント</td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> Microfil 34ゲージ、67ミリ（電極の充填材） </td><td>世界の精密機器</td><td> MF34G - 5 </td><td> http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td>マイクロダイセクションのツール（鉗子、...） </td><td>ファイン科学ツール</td><td></td><td> www.finescience.com </td></tr><tr><td>解剖（ステレオ）顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td> http://www.leica-microsystems.com/ </td></tr><tr><td>ファラデー箱</td><td>未知のメーカー</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>その他：プラスチック製の注射器、タングステンのアース線とNaOHシャープタングステン電極、塩化カリウム、ワックスのプラットフォーム、モニターとPCを...

の巨大線維経路からの電気生理学的記録 d.キイロ</em

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

ときに大人を驚かせたD.キイロは空中にジャンプし、離れて飛んで反応する。 D.を含む多くの脊椎動物種、でキイロ 、&quot;エスケープ&quot;（または&quot;驚愕&quot;）成人段階で応答が多成分の神経回路によって媒介されるには、ジャイアントファイバーシステム（GFS）と呼ばれる。ニューロン、彼らの独特の形態とシンプルな接続性の比較大きなサイズは、GFS神経回路を研究するための魅力的なモデルシステムにします。 GFSの経路は、その軸索は子宮頸部の結合を介して胸部神経節への正中線に沿って脳から降りるtwo左右対称の巨大な繊維（GF）介在ニューロンで構成されています。腹側神経節tergotrochanteral筋肉を駆動する同側motorneuron 1）大規模な内側デンドライト（TTMn）（TTM）、mesothoracic大腿骨/足の主な伸筋とGFSのフォームは、電気化学的シナプスのmesothoracic神経分節（T2）で、および2）対側には、末梢背側縦筋（DLMS）、翼圧子のmotorneurons（DLMns）とターン形態の化学物質（コリン作動性）シナプス介在ニューロン（PSI）をsynapsing。彼らは翼に直接接続されるのではなく、移動 - dorsovental筋肉（DVMs）への神経経路（複数可）、翼エレベーターは、まだ（DLMSとDVMsが間接飛翔筋と共同で知られて働いたされていない歪曲近くの胸部キューティクルによって間接的に翼）（キングとワイマン、1980;。Allenら 、2006）。 DLMSのジ - シナプス活性化（PSIを介して）はTTMSが最初に大腿骨を延長して推進することができますTTMの単シナプス活性化（〜0.5 ms）の相対的なこれらの筋肉の収縮のタイミングで小さいながらも重要な遅延を引き起こす地面を飛んでいく。順番に相互に飛行の間、DVMsをストレッチアクティブストレッチアクティブDLMS同時にTTMS。 GFの経路は、脳に超えたしきい値電気刺激（ここで説明する）によって直接感覚（例：&quot;空気パフ&quot;または&quot;ライトオフ&quot;）刺激を適用することによって間接的に活性化、またはすることができます。 TTMnsとDLMnsはまだ正体不明の、感覚入力として、他の持っていないものの、どちらの場合でも、活動電位は、単独でGFS、PSIS、とTTM / DLM運動ニューロンを介してTTMSとDLMSに達する。 &quot;遅延の応答&quot;（刺激と筋肉の脱分極間の時間）とを測定（高周波の刺激の一定の数に成功したレスポンスの数）&quot;高頻度の刺激に続くのは、&quot;再現性と定量機能状態を評価する方法を提供します中央のシナプス（GF - TTMn、GF - PSI、PSI - DLMn）と化学の両方を含むGFS成分、（グルタミン酸）の神​​経筋接合部（TTMn - TTMとDLMn - DLM）。それは中央のシナプス形成に関与する遺伝子を同定し、中枢神経系機能を評価するために使用されています。

ジャイアントファイバシステムでは、成人の単純な神経回路です。<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;フライの最大のニューロンを含む。私たちは、ジャイアントファイバ介在の直接の刺激後に背側縦（DLM）とtergotrochanteral（TTM）の筋肉に後シナプス電位を記録することによって、この経路を介してシナプス伝達を監視するためのプロトコルについて説明します。

の巨大線維経路からの電気生理学的記録 D.キイロ</em

成体 D. melanogaster は、驚いた際に空中に跳ね上がり、飛び去ることで反応します。D. melanogaster を含む多くの無脊椎動物において、この「逃避」は...

本手順の全体的な目的は、巨大線維への直接刺激の後、背側縦走筋（DLM）およびTogo tro cantoral筋（TTM）からポストシナプス電位を記録することにより、巨大線維経路を介したシナプス伝達をモニタリングすることです。これは、まず少量のワックスを入れたディッシュ内で麻酔をかけたハエを適切に固定することで行われます。手順の次のステップは、刺激電極、接地電極、および記録電極をハエに挿入することです。手順の最終ステップは、脳を刺激し、跳躍筋および飛行筋からの反応を記録することです。最終的に、遺伝子型、齢、温度などの関数として、巨大繊維経路の機能的特性の変化を示す結果を得ることができます。これは、刺激から反応までの時間を記録し、高頻度の連続刺激後に得られた成功反応の数をカウントすることによって行われます。この手法は、神経生理学分野におけるいくつかの重要な疑問の解決に寄与し、神経路の機能的特性の解析に役立ちます。本手法は、その後の遺伝学的または分子生物学的解析へと繋がる導入実験として、あるいは既知の変異を持つ動物における生理学的・機能的特性を評価する方法として利用可能です。本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。準備および損傷させる工程の習得には時間を要します。ショウジョウバエは比較的小さいため、実験を正しく行うには、ある程度の安定性と協調性を身につける必要があります。これらの実験では、刺激装置、刺激分離ユニット、2台のマイクロ電極アンプ、データ収集システム、および収集ソフトウェアをインストールしたコンピュータで構成される標準的な電気生理学セットアップを使用します。追加の設備として、ファラデーケージ、ブームスタンド付き実体顕微鏡、除振台、光源、および記録プラットフォームを使用します。5台のマイクロマニピュレーターを使用します。そのうち2台のマイクロマニピュレーターは、記録電極を配置するための微動調節機能が必要であり、残りの3台のマイクロマニピュレーターは粗動調節機能のみで十分です。2本の刺激電極と接地電極を配置するため、DLM記録電極用マニピュレーターを標本の尾端に配置します。TTM記録電極用マイクロマニピュレーターは、実験者と標本側面の間に配置します。刺激電極用の2本のマイクロマニピュレーターは、標本の頭端に配置します。接地電極用のマイクロマニピュレーターを、試料の遠側に配置します。抵抗値が40から60 mega ohmsのガラス記録用微小電極をプルし、ワックスで固定したディッシュに平らにして保管します。刺激には、電磁的に研磨した2本のタングステン電極を使用します。ステムワイヤーまたは3つ目の電磁気的に作製された電極を使用します。接地として、実験セッションの開始前に、刺激電極と接地電極をマイクロマニピュレーターに取り付けてください。セッションの間、これらの電極を交換する必要はありません。装置のセットアップが完了したら、ショウジョウバエの準備を行います。氷上で10〜15分間冷却し、ハエを麻酔させます。ピンセットを用いて、ハエの脚をそっと掴み、約45度の傾斜がついたソフトワックスのプラットフォームが入ったシャーレに移動させます。次のステップは、ハエをワックスで固定することです。ハエの腹側を下に向け、前方が斜面の上方を向くように配置します。細いピンセットを使用して、脚をペアごとに外側に広げ、ワックスに押し込みます。本実験を開始する前に、記録対象となる筋肉の位置、すなわち背縦筋（DLM）および胸側筋（TTM）を確認してください。DLMの皮下付着部位は、胸部正中線と前背剛毛の間の領域に相当します。TTMの付着部位は、後および前上翼剛毛の背側に位置しています。翼がDLMまたはTTM線維へのアクセスを妨げないよう、翼を外側に広げ、ワックスで固定します。微細鑷子を用いて、PSISを慎重に外側に引き、ワックスに浸して固定してください。probosは柔らかく、頭部の他の部分から外れやすいため、この工程には習熟が必要です。もし外れてしまった場合は、そのハエを廃棄し、最初からやり直してください。頭部をこのように固定できなかった場合、眼を通じて刺激電極を挿入する際に問題が生じます。ハエをワックスで固定したら、試料をステレオ顕微鏡下に配置します。ファラデーケージ内でハエを横向きに置き、ハエの頭が実験者の右側にくるように調整します。次のステップは電極の挿入です。適切な配置とその後の記録を容易にするため、マイクロマニピュレーターを用いて電極を挿入部位に近づけます。顕微鏡を覗かずに、マイクロマニピュレーターの調整ホイールを使用して接地電極を腹部の後端に挿入し、先端を鋭利にしたタングステン刺激電極を脳内に配置します。マイクロマニピュレーターを使用して、電極の一方の先端がハエの片方の目にちょうど触れる位置に調整します。もう一方の電極についても同様に行い、両方の電極がそれぞれの目の外側にちょうど触れている状態にします。その後、電極を押し込みます。各眼を約2〜3mm回転させ、電極の先端が頭殻の後方に位置する脳に到達するようにします。電極が正しく配置されていれば、刺激電極が適切に設置されているかを確認するために、巨大繊維系を活性化させることができます。刺激電極に30〜60 Vの短い刺激を与え、翅の動きや飛翔筋または脚筋の痙攣を確認してください。次のステップでは、Hamiltonシリンジまたは加熱延伸プラスチックシリンジを用いて、ガラスマイクロ電極に3 Mの塩化カリウムを満たし、それらを精密制御マイクロマニピュレーターに装着します。適切に挿入されたマイクロ電極は、数回の実験ラウンドに使用することが可能です。最初の記録電極をDLM線維に挿入します。左右対称に2つのdlmが存在します。それぞれは6本の個別の筋線維で構成されています。記録はこれら6本の線維のいずれからでも行えますが、胸部クチクラの背面からアクセスしやすく、また両方の線維が同一の運動ニューロンによって支配されているため、DLM線維 45 A および 45 B が最も一般的に使用されます。プレパレーションインサーターの尾端に配置したマイクロマニピュレーターを使用し、ハエの最も遠い側のDLM fiber 45 AまたはBに記録電極を挿入します。プラットフォームの傾斜により、DLM電極を背面クチクラに対して60〜90度の角度で挿入することができ、オシロスコープモードのソフトウェアを用いることで貫通が容易になります。記録電極を胸部に挿入する際は、コンピューターモニターを確認してください。電極が筋肉に入ると、ベースラインがほぼ0または負の値まで低下します。単一刺激を与え、筋肉の反応が観察できるかを確認してください。もう一方の記録電極を、自分に近い側のハエのTTMに挿入します。筋肉の付着部位の位置により、この電極は目の前側から側方に挿入します。ここでも、作業中はモニターを観察してください。トレースによって電極が筋肉内にあることが示されたら、単一刺激を与えて筋肉反応を誘発させます。脳への刺激を開始し、脚および飛行筋からの反応を記録するには、刺激電極間に0.03 millisecondの刺激を与えます。電圧は30 voltsから開始し、コンピューターモニター上で筋肉の収縮と筋細胞の脱分極が観察されるまで60 voltsまで上げてください。実験の残りの工程では、電圧を反応閾値よりも5〜10 V高く設定します。反応潜時を測定するため、刺激間に5秒間の休止時間を設けて、少なくとも5回の単一刺激を与えてください。異なるレートで刺激列を提示し、それに続く頻度を決定します。通常、10回の刺激からなる10本の刺激列を100 hertz、200 hertz、および300 hertzで提示し、各刺激列の間に2秒間の休息時間を設けます。この図は、脳への単一刺激後にTTMsおよびdlmsから記録された反応を示しています。反応潜時とは、脳への刺激から筋肉の脱分極までの時間のことです。G-F-T-T-M経路で0.7～1.2ミリ秒、GF DLM経路で1.2～1.7ミリ秒の潜時が得られれば、サンプルの調製が良好であり、記録手法が適切であることを示しています。潜時は、ここで示すように、遺伝子型、遺伝的背景、温度、および齢によって変動します。TTMからの記録では、大型のDLM線維からの記録と比較して、シナプス後電位の振幅および波形においてより大きな変動が見られます。この変動の増大は、TTM筋線維のサイズが小さいことに起因します。しかしながら、この変動は、巨大線維からTTMへの経路における反応潜時値には影響しません。この図は、100 Hzおよび200 HzでのTTMおよびDLMの刺激を示しています。TTMとDLMはともに、200 Hzでの10回すべての刺激に反応します。TTMの反応は1対1のまま維持されますが、DLMの反応は不全に陥り始めます。100 Hz以上の刺激周波数でDLMの追随に失敗する理由は、2つの介在ニューロン間の介在化学シナプスが、刺激間に十分な回復時間を有していないためです。この手法を習得すれば、約30分で完了させることができます。このビデオを視聴することで、巨大繊維経路を介した神経伝達のモニタリング方法について十分に理解できるはずです。これは、脳内のニューロンへ向かう巨大繊維を刺激し、その後、胸部の跳躍筋および飛翔筋から記録を行うことで実施されます。

electrophysiological-recordings-from-giant-fiber-pathway-d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ここでは、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部でシナプス伝達を測定するための電気生理学的方法を説明します。誘発放出は、運動ニューロンの軸索を刺激することによって人工的に開始され、NMJの透過は、筋肉に誘発シナプス後応答によって測定することができる。...

ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

の電気生理学的記録ショウジョウバエ胚

成人の全体のマウントの準備ショウジョウバエ</emジャイアント繊維染料注入のための>腹神経索

用いて、化合物の生理活性をスクリーニングするためのペアNanoinjectionと電気生理学的アッセイキイロショウジョウバエジャイアントファイバシステム

このビデオは、ショウジョウバエの幼虫の中枢神経系(CNS)からのニューロン活動の細胞外記録を示しています。切除されたCNSは記録チャンバー内に配置され、下行神経からの電気的活動が記録されてベースラインの発火頻度が確立されます。次に、試験剤を導入し、発火頻度の変化を記録して、薬剤の興奮性または抑制性の効果を決定します。...

ショウジョウバエの中枢神経系における電気的活動の細胞外記録

このプロトコルは、 ショウジョウバエにおいてlabellar味覚ニューロンによって発射活動電位応答の細胞外記録を記述する。...

から電気生理学的記録<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt; Labellar味感覚器

Sharp微小電極は、生きたショウジョウバエの光受容体および視覚介在ニューロン出力の正確な電気生理学的特性評価を可能にします。ここでは、この方法を使用して、制御された光刺激に対する個々の細胞の高品質な電圧応答を記録する方法を示します。この手法は、昆虫の複眼における神経情報処理の研究に最適です。...

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;光刺激に感光体と介在ニューロン<em&gt;インビボ</em

ショウジョウバエmelanogaster光受容体からの全細胞記録は、様々な条件下での自然発生的な暗いバンプ、量子隆起、光に対する肉眼的応答、および電流 - 電圧関係の測定を可能にする。 D. melanogaster遺伝子操作ツールと組み合わせて、この方法は、遍在するイノシトール - 脂質シグナル伝達経路およびその標的であるTRPチャネルの研究を可能にする。...

全細胞電圧クランプ記録のための電気生理学的方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;感光体

ショウジョウバエ第 3 齢幼虫神経筋接合部シナプス...

ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部のシナプス電流の焦点 Macropatch 録音

このプロトコルは、コスト効率的かつ便利な神経蛋白質の遺伝の突然変異の薬理学的エージェントのテストを有効にするショウジョウバエ中枢神経系の降下の電気的活動を記録する方法をについて説明しますや未踏の生理学的経路の役割。...

第三令キイロショウジョウバエの中枢神経活動の電気生理学的記録

このプロトコルは、無傷の ショウジョウバエ...

無傷の ショウジョウバエ 幼虫のレーザー細胞アブレーションにより、シナプスの競合が明らかになる

学ぶDrosophila melanogasterの巨大線維系におけるシナプス伝達の電気生理学的記録法。DLMとTTM筋からの興奮性シナプス後電位を測定し、神経回路の機能特性を評価する手法です。

の巨大線維経路からの電気生理学的記録 D.キイロ

さらに動画を探す