JoVE 実験百科事典
微生物学
0 回視聴 • 2:04 分 • October 30th, 2025
コールドバッファーに懸濁した野生型 Dictyostelium discoideum アメーバ細胞から始めます。
このバッファーは、膜の安定性を維持するイオン環境を提供します。
次に、標的遺伝子を持つプラスミドが入ったチューブにアメーバ細胞を加えます。
溶液を穏やかに混合して、プラスミドをアメーバ表面に密着させます。
この混合物を事前に冷却したエレクトロポレーションキュベットに移し、エレクトロポレーションを行います。
エレクトロポレーション中、電気パルスは細胞膜に一時的な細孔を作成します。
プラスミドはこれらの細孔を通って細胞質に入り、その後核に移行します。
次に、アメーバ細胞をフィーダーバクテリアを添加した液体培地を含むペトリ皿に移します。
アメーバは食作用によって細菌を消費し、細胞の回復に不可欠な栄養素を提供し、プラスミドの発現を可能にします。
フィーダーバクテリアは、細菌なしで増殖する特別な株を必要とせずに、野生型アメーバ細胞でのトランスフェクションをサポートします。
細胞をH40バッファーに再懸濁します。
次に、1〜2マイクログラムのDNAを含むチューブに100マイクロリットルの細胞を加えます。ピペットを上下にピペットで混合し、細胞DNA混合物を事前に冷却したエレクトロポレーションキュベットに移します。
2マイクログラムを超えるDNAを追加しないでください。DNA濃度が高いと細胞に毒性があり、効率が低下します。
エレクトロポレーション後、すぐに細胞を準備した10センチメートルのシャーレに移し、細胞を5時間回復させます。