$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
親水性タンパク質、リポタンパク質、タンパク質凝集体を含む細菌溶解物を取ります。
暖かい温度で相分離できる冷たい非イオン性洗剤を追加します。
氷の上でインキュベートし、定期的に混合します。界面活性剤はリポタンパク質の脂質部分に結合し、タンパク質と界面活性剤の複合体を形成します。
混合物を温めて相分離を誘発します。リポタンパク質は界面活性剤相に濃縮されますが、親水性タンパク質は水相にとどまります。
二相性分離を維持するために室温で遠心分離します。
水相を捨て、界面活性剤相にコールドバッファーを加えて混合します。
冷却、加温、遠心分離のサイクルを繰り返して、リポタンパク質を濃縮します。
次に、低温緩衝液を加え、低温で遠心分離して、非リポタンパク質凝集体をペレット化します。
上清をタンパク質沈殿溶媒の入ったチューブに移し、氷点下の温度でインキュベートしてリポタンパク質を沈殿させます。
室温で遠心分離し、上清を廃棄します。
沈殿したリポタンパク質は、下流の研究の準備が整います。
氷冷したTBSEに等量の4%界面活性剤を添加することにより、上清にTX-114界面活性剤を最終濃度2%まで補充します。補充した上清を氷上で1時間インキュベートし、15分ごとに反転して混合します。チューブを摂氏37度のウォーターバスに移し、10分間インキュベートして相分離を誘導します。
サンプルを室温で10,000倍gで10分間遠心分離し、二相性分離を維持します。上部の水相をそっとピペットで取り除き、廃棄します。氷冷したTBSEを下部界面活性剤相に加えて、チューブを元の容量まで補充し、反転させて混合します。
氷上で10分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを摂氏37度のウォーターバスに移し、10分間インキュベートして相分離を誘導し、室温で10,000倍gで10分間遠心分離します。これらの手順を合計3回分離するためにもう一度繰り返した後、上部の水相を取り除き、廃棄します。
界面活性剤相に1容量の氷冷TBSEを加えることにより、抽出の過程で形成された沈殿タンパク質のペレットを除去します。摂氏4度、gの16,000倍で2分間遠心分離し、不溶性タンパク質をペレット化します。すぐに上清を1,250マイクロリットルの100%アセトンを含む新しい2.0ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
サンプルを反転して混合し、摂氏マイナス20度で一晩インキュベートしてタンパク質を沈殿させます。翌日、サンプルを室温で20分間16,000倍gで遠心分離し、チューブの向きに注意しながらリポタンパク質をペレット化します。ペレットを100%アセトンで2回洗浄してから、アセトンをデカントし、サンプルを自然乾燥させます。
次に、20〜40マイクロリットルの10ミリモルTris-HCL、pH 8.0を加え、沈殿したリポタンパク質で壁に対して上下にピペッティングしてペレットを完全に再懸濁します。