急速平衡透析法による結核病変からのカゼウムへの薬物結合の測定

薬剤耐性の抗酸菌を中心に含む結核病変からの壊死性の脂質が豊富な物質であるカゼウムの均質な懸濁液を取ります。

試験薬をホモジネートとボルテックスに追加して、カゼウムマトリックスとの相互作用を促進します。

半透膜で区切られた急速平衡透析インサートを含むドナーチャンバーとレシーバーチャンバーをベースプレートに配置します。

薬物をスパイクしたホモジネートをドナーチャンバーにロードし、レシーバーチャンバーにバッファーを追加します。

プレートを密封し、回転しながらインキュベートします。

インキュベーション中、遊離薬物は膜を横切って拡散し、両方のチャンバー間で平衡に達します。

平衡に達したら、ドナーサンプルをバッファーで希釈し、レシーバーサンプルを薬物を含まないホモジネートで希釈して、薬物定量のためのマトリックス条件を正規化します。

最後に、薬物濃度を定量化し、結合していない薬物画分またはfuを計算します。

fuは、カゼウムに拡散し、薬剤耐性の抗酸菌に到達するために利用可能な遊離薬物を反映しています。

調製した試験化合物6.5マイクロリットルを643.5マイクロリットルのホモジネートに加えます。5マイクロモルとボルテックスの最終濃度を達成するため。

次に、赤いインサートをベースプレートに配置します。各テストのインサートを準備し、各化合物を3回に分けて準備します。

200マイクロリットルの薬物スパイクマトリックスを、各赤いインサートの赤いドナーチャンバーに加えます。次に、350マイクロリットルのPBSを各レシーバーチャンバーに追加します。

プレートに粘着シールを置き、サーマルミキサー上で摂氏37度で毎分200回転で4時間インキュベートします。インキュベーション後、ドナーチャンバーとレシーバーチャンバーの内容物を上下に2〜3回ピペッティングして穏やかに混合します。各ドナーチャンバーから20マイクロリットルのホモジネートを、1.5ミリリットルのチューブ内の20マイクロリットルのクリーンPBSに移します。

同様に、20マイクロリットルのPBSサンプルをレシーバーチャンバーから20マイクロリットルのクリーンホモジネートに移します。

マトリックスマッチングにより、定量分析のためにホモジネートとPBSに2つの別々の色覚曲線を作成する必要がなくなります。ドナーチャンバーの内容物は、時間の経過とともに沈殿する可能性があります。アリコートを取り出す前に、ピペッティングで内容物を穏やかに混合します。