枯 草菌 胞子の生産とエアロゾルベースの沈着

まず、耐性の高い胞子形成細菌である 枯草菌の培養から始めます。

培養物を栄養制限のある培地に接種し、曝気でインキュベートして胞子形成を誘導します。

胞子形成細胞は、保護層を持つ休眠胞子を生成します。

培養物をチューブに移し、遠心分離して胞子をペレット化します。残留細胞と破片を含む上清を取り除きます。

ペレットを滅菌蒸留水で洗浄し、遠心分離を繰り返し、胞子を滅菌水に再懸濁します。

位相差顕微鏡を使用して、明るい波子を識別し、汚染物質がないことを確認することで胞子の純度を確認します。

胞子の連続希釈を行い、栄養寒天にプレートし、インキュベートして、生存可能な胞子をコロニーに発芽させます。コロニーを数えて胞子濃度を決定します。

この濃度に基づいて、胞子量を調整し、希釈したサンプルをエアロゾルノズルにロードします。懸濁液が急速に乾燥して胞子の薄く均一な単層を形成する滅菌ガラス表面にスプレーします。

胞子生産を行うには、適切な抗生物質を添加したそれぞれの 枯草菌 株の5ミリリットルの一晩培養物を200ミリリットルの倍倍強度液体シェファー胞子形成培地に移し、培養物の95%以上が胞子化されるまで、摂氏37度で少なくとも72時間以上活発に曝気して培養します。15ミリリットルチューブで胞子を3000 gで15分間遠心分離して収穫し、無菌蒸留H₂Oを使用してサンプルを洗浄ステップを繰り返して精製します。

位相差顕微鏡で純度と発芽状態をチェックし、胞子懸濁液が位相光沢胞子の99%以上で構成され、栄養細胞、発芽胞子、および細胞破片が含まれていないことを確認します。LB寒天培地に50マイクロリットルの10倍の連続希釈液をプレーティングしてCFUを計算し、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートすることにより、胞子力価を決定します。CFUの測定に続いて、濃縮するか滅菌水を使用してサンプルを希釈することにより、サンプルを1ミリリットルあたり10〜9個の胞子に調整します。

滅菌された顕微鏡スライドまたは丸い25mmのカバースリップの形でサンプルキャリアを、ノズルと一直線に電動エアゾールスプレーユニット内に配置します。胞子培養物をノズル液入口に移し、1.3 barの圧力で0.15秒で噴霧を開始します。噴霧された胞子懸濁液は、顕微鏡スライド上に薄膜を形成し、数秒以内に急速に乾燥して均一に分布した胞子単層を形成します。処理したサンプルキャリアを滅菌容器に入れて室温で保管します。