フローサイトメトリーを用いた Microcystis aeruginosa の生存率解析

生きた細胞と死んだ 緑膿 嚢胞細胞の別々のサンプルを採取します。

サンプルを混合して、結合母集団を作成します。

ミクロシスチス には、生細胞では無傷のままであるが、死んだ細胞では分解される自家蛍光色素であるフィコシアニンが含まれています。

サンプルをボルテックスして塊を破壊し、均一な単一細胞懸濁液を生成します。

細胞膜不透過性の核酸結合蛍光プローブを加え、光退色を防ぐためにサンプルを暗所でインキュベートします。

プローブは、損傷した膜を通って死細胞に選択的に入り、細胞内DNAに結合します。

サンプルをフローサイトメーターに通し、適切な励起波長レーザーを使用してフィコシアニン自家蛍光と核酸プローブ蛍光を測定します。

生細胞は強いフィコシアニン自家蛍光を放出しますが、プローブシグナルは示しません。

対照的に、死んだ細胞は色素放出の減少とプローブ蛍光の上昇を示し、膜の損傷を確認します。

これにより、色素が豊富な生細胞と死細胞を同定することができます。

分子プローブ細胞の取り込みを最適化するには、以前に調製した単培養物の半分を、死んだコントロールを生成するための適切な条件にさらします。サンプルの微小環境の変化をチェックして、培養物の死を確認します。そして、先ほど示したようにコロニー形成を分解します。

次に、緑色とオレンジ色の核酸プローブからの蛍光を記録できる検出器と一緒に488ナノメートルのレーザーを選択します。そして、640ナノメートルのレーザーは、それぞれの検出器を介してフィコシアニン信号を記録します。