ショウジョウバエにおける腸内関連細菌のコロニー形成単位の定量化

ショ ウジョウバエ から調製されたホモジネートを含むマイクロプレートから始めます。これらのハエは、腸内に特定の細菌の制御された個体群を保有していました。

ホモジネートには、溶解されたハエ組織と放出された腸内細菌が含まれています。

浮遊細菌を吸引し、複数のマイクロプレートにわたって連続的に希釈します。

各希釈液から寒天プレートに少量の液量をスポットし、液滴が分離されたままであることを確認します。

インキュベートして、細菌が目に見えるコロニーに増殖できるようにします。

プレートの画像をキャプチャして、個々のコロニーを形成できる生菌細胞の数を表すコロニー形成単位(CFU)を定量化します。

画像解析ソフトウェアを使用して、基準線を使用して各画像を整列させ、境界を定義し、均一なグリッドを適用して、それぞれが単一のスポットに対応するカウントゾーンに分割します。

輝度のしきい値を調整して個々のコロニーをバックグラウンドから区別し、分析を実行して各スポットのコロニーをカウントし、CFUを定量化します。

蓋を開けた3つの長方形のMRS寒天培地プレートをバイオセーフティキャビネットに入れ、少なくとも10分間乾燥させます。96チャンネルピペッターを使用して、滅菌96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルのPBSを加えて、2つの希釈プレートを調製します。P-20チップのラックを96チャンネルピーターにロードします。

サンプルプレートから11.1マイクロリットルのホモジネートを吸引して、1:10に希釈します。次に、ウェルあたり100マイクロリットルの滅菌PBSを含む最初の希釈プレートに分注します。希釈プレートをプレートシェーカーに600RPMで10秒間置きます。

少なくとも10回上下にピペッティングして、もう一度混合します。11.1マイクロリットルを最初の希釈プレートから2番目の希釈プレートに移し、さらに希釈するために混合ステップを繰り返します。スポッティングプレートの場合は、各ウェルから2マイクロリットルを96チャンネルピペッターにロードします。

寒天に刺さらないようにピペッターヘッドをプレートにゆっくりと下げ、すべてのスポットが分注されていることを確認します。次に、液体の斑点が寒天にすばやく浸透し、一緒に流れないようにしてください。原稿に記載されているように、残りの希釈プレートについてめっきプロセスを繰り返します。

液体が寒天に完全に吸収されたら、プレートを反転させ、コロニーが最適なサイズに達するまでインキュベートします。プレートを論理的に整理し、撮影中は特定の順序で保管してください。A1がすべてのプレートの左上隅になるように向きを変えます。

プレートの蓋を取り外した後、A1を正しい角に向けてステージにプレートを置きます。プレートを画像化します。画像をコンピューターに転送し、実験名、培地の種類、希釈係数、その他の関連詳細などの名前を変更します。

定量化のために処理する画像をフォルダーに整理します。プレートを区別するファイル名は、出力スプレッドシート内のカウントセットごとに列タイトルになります。フォルダー内に Cropped と Receipts という名前のサブフォルダーを作成します。

これらのフォルダーは出力ファイルを受信します。次に、ImageJ から Croptacular プラグインを起動し、[OK] をクリックしてトリミングを開始します。ソースフォルダを選択するためのダイアログボックスがポップアップ表示されます。

[OK] をクリックします。ソース フォルダを選択し、[開く] をクリックします。次に、リンク先ディレクトリを選択するためのダイアログボックスで[OK]をクリックします。保存先フォルダを選択し、[開く]を押します。

画像がすでにまっすぐな場合は、スペースを押すだけです。それ以外の場合は、水平になるはずのエッジに沿って線を引いて、画像をまっすぐにします。画像がまっすぐに表示されない場合は、必要な回数だけ線を描き直します。

次に、カウント領域の境界ボックスを描画し、すべてのスポットがセル内に入るまでそのサイズと比率を調整します。境界ボックスの外側にカーソルをドラッグして、グリッドを更新します。グリッドが正常に表示されたら、スペースキーを押します。

プラグインはすべての写真が同じように配置されていることを前提としているため、次の画像が最初の画像と同じ角度に自動的に回転するようにしてください。これが正しい場合は、スペースを押して続行します。それ以外の場合は、以前と同じように画像をまっすぐにします。

グリッドは、前の画像と同じ位置も呼び起こします。必要に応じて調整し、スペースキーを押します。Count-On-It を起動し、[Gridiron] を選択します。

しきい値コロニー強度は、ピクセル強度の上限値と下限値に基づいて設定します。すべてのコロニーを選択しながら、しきい値をできるだけ厳しくします。しきい値が満足のいくらになったら、[アクションが必要] ダイアログボックスの [OK] をクリックし、[OK] をクリックして続行します。

最初の画像では、セットアップメニューに進むか戻るかのオプションが表示されます。バッチ処理を続行するには、[OK] をクリックします。次に、領収書と結果のテーブルを保持するフォルダーを選択します。先ほど作成した [領収書] フォルダーを使用します。

最初の画像の後、次の画像は、以前の設定と同じしきい値にデフォルトで設定されます。[OK] をクリックして、これらの設定を使用するか、設定を調整します。