ショウジョウバエにおける腸内関連細菌のコロニー形成単位の定量化

ショ ウジョウバエ から調製されたホモジネートを含むマイクロプレートから始めます。これらのハエは、腸内に特定の細菌の制御された個体群を保有していました。

ホモジネートには、溶解されたハエ組織と放出された腸内細菌が含まれています。

浮遊細菌を吸引し、複数のマイクロプレートにわたって連続的に希釈します。

各希釈液から寒天プレートに少量の液量をスポットし、液滴が分離されたままであることを確認します。

インキュベートして、細菌が目に見えるコロニーに増殖できるようにします。

プレートの画像をキャプチャして、個々のコロニーを形成できる生菌細胞の数を表すコロニー形成単位(CFU)を定量化します。

画像解析ソフトウェアを使用して、基準線を使用して各画像を整列させ、境界を定義し、均一なグリッドを適用して、それぞれが単一のスポットに対応するカウントゾーンに分割します。

輝度のしきい値を調整して個々のコロニーをバックグラウンドから区別し、分析を実行して各スポットのコロニーをカウントし、CFUを定量化します。

蓋を開けた3つの長方形のMRS寒天培地プレートをバイオセーフティキャビネットに入れ、少なくとも10分間乾燥させます。96チャンネルピペッターを使用して、滅菌96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルのPBSを加えて、2つの希釈プレートを調製します。P-20チップのラックを96チャンネルピーターにロードします。

サンプルプレートから11.1マイクロリットルのホモジネートを吸引して、1:10に希釈します。次に、ウェルあたり100マイクロリットルの滅菌PBSを含む最初の希釈プレートに分注します。希釈プレートをプレートシェーカーに600RPMで10秒間置きます。

少なくとも10回上下にピペッティングして、もう一度混合します。11.1マイクロリットルを最初の希釈プレートから2番目の希釈プレートに移し、さらに希釈するために混合ステップを繰り返します。スポッティングプレートの場合は、各ウェルから2マイクロリットルを96チャンネルピペッターにロードします。

寒天に刺さらないようにピペッターヘッドをプレートにゆっくりと下げ、すべてのスポットが分注されていることを確認します。次に、液体の斑点が寒天にすばやく浸透し、一緒に流れないようにしてください。原稿に記載されているように、残りの希釈プレートについてめっきプロセスを繰り返します。

液体が寒天に完全に吸収されたら、プレートを反転させ、コロニーが最適なサイズに達するまでインキュベートします。プレートを論理的に整理し、撮影中は特定の順序で保管してください。A1がすべてのプレートの左上隅になるように向きを変えます。

プレートの蓋を取り外した後、A1を正しい角に向けてステージにプレートを置きます。プレートを画像化します。画像をコンピューターに転送し、実験名、培地の種類、