金属応答性遺伝子の役割を研究するための金属制限細菌増殖アッセイ

野生型に存在する特定の金属応答性遺伝子を欠く野生型細菌と変異型細菌を取り上げます。

バクテリアは、内部の金属貯蔵量を使い果たすために、金属が枯渇した培地で増殖します。

この金属が枯渇した環境では、野生型細菌の金属応答性遺伝子が活性化され、変異細菌にはない表面受容体を発現します。

均一な細胞密度を確保するために培養物を希釈します。

金属 - タンパク質複合体を含むマルチウェルプレートを取ります。

希釈した培養物をウェルに加えます。

プレートリーダー内でプレートをインキュベートし、制御された温度に保たれ、最適な細菌増殖を促進するために振とうします。

吸光度を定期的に測定して、細菌の増殖を経時的に監視します。

野生型細菌では、金属受容体が複合体からの金属イオンの抽出を可能にし、その増殖をサポートします。

変異細菌は、金属受容体なしで複合体から金属イオンを抽出できないため、成長が制限されています。

10マイクロリットルの10Xプレミックスと90マイクロリットルのCDMを、ブランクコントロールの3つのウェルのそれぞれに加えます。

サイドアームフラスコ内の培養物が2倍になったら、マイクロプレート内の未使用のウェルに各培養物を100マイクロリットルを加え、600ナノメートルで光学密度を測定します。

培養物を600ナノメートルの0.02の光学密度にするために必要な正しい希釈量を計算した後、小さな培養チューブで培養物をCDMで希釈し、プレート内で10倍のプレミックスを1倍に希釈するのに十分な量を追加します。

次に、プレートをプレートリーダーに8〜12時間振とうしながら置き、所望の実験間隔で600ナノメートルの読み取り値で光学密度を取得します。