JoVE 実験百科事典
微生物学
0 回視聴 • 3:08 分 • November 5th, 2025
まず、淋 菌 培養物を金属が枯渇した培地で増殖させます。
金属の希少性は、利用可能な場合に金属の取り込みを開始する外膜トランスポーターの発現を引き起こします。
湿ったろ紙の上にあらかじめ浸したニトロセルロース膜を置き、ドットブロット装置を組み立てます。
細菌細胞を見つけて、液体を吸収させます。
装置を分解し、メンブレンを取り外し、自然乾燥させます。
非特異的結合を防ぐためにブロッキング剤を追加します。
メンブレンを装置に再度挿入し、パラフィルムで密封して、再組み立てします。
宿主由来の金属結合リガンドを加え、振とうしながらインキュベートします。
リガンドは細菌トランスポーターに結合します。
液体を取り除き、メンブレンを洗浄して、結合していないリガンドを除去します。
リガンド特異的一次抗体を加え、続いて酵素結合二次抗体と着色生成物を形成する比色検出試薬を加えます。
目に見えるシグナルは、金属制限条件下での細菌の金属トランスポーターの発現を示します。
質量倍増インキュベーション後、培養物を3容量のCDMで逆希釈します。次に、培養物を摂氏37度で4時間振とうしながらインキュベートします。4時間の直前に、3枚のろ紙と1枚のニトロセルロースを、ドットブロット装置に収まるのに必要なおおよそのサイズにカットします。
ニトロセルロースを脱イオン水に約10分間事前に浸してから、ニトロセルロースの下のろ紙で装置を組み立てます。インキュベーションの最後に、細胞密度を記録し、密度を適切な最終密度に標準化します。次に、細胞培養物をニトロセルロースにピペットで移します。
濾紙がすべての液体を吸収したら、装置を分解し、ブロットを乾燥させます。適切なブロッキング溶液でニトロセルロース膜を1時間ブロックし、ドットブロット装置を再組み立てし、ろ紙をパラフィンフィルムに置き換えて、ニトロセルロースの下に漏れ防止シールを作成します。目的の金属結合リガンドをブロッカーで0.2マイクロモルに希釈し、適度に振とうしながら細胞を1時間プローブします。
インキュベーションの最後に、真空で液体を吸い上げ、ブロットを洗浄し、標準的な免疫学的手順に従ってシグナルを発生させます。