JoVE 実験百科事典
微生物学
0 回視聴 • 3:38 分 • October 30th, 2025
GFPの誘導遺伝子と分泌シグナルタグ付き変異ルシフェラーゼを保有する Mycobacterium smegmatis の培養を取ります。
変異遺伝子は不活性なルシフェラーゼをコードしていますが、タンパク質合成中の自然な誤翻訳により活性酵素が生成されます。
GFPは、ルシフェラーゼ発現を正常化するための内部コントロールとして機能します。
インデューサーを加えて遺伝子発現を開始し、培養物をマルチウェルプレートに分注します。
選択したウェルに試験分子の濃度を上げて導入します。インキュベート。
制御条件下では、誤翻訳により活性なルシフェラーゼ分泌が起こります。
試験分子が誤訳を阻害すると、活性ルシフェラーゼ分泌が減少します。
培養アリコートを黒色プレートに移し、GFP蛍光を測定します。
遠心分離機で細胞をペレット化します。
分泌されたルシフェラーゼを含む上清を移し、活性ルシフェラーゼがその酸化を触媒して発光する基質を加えます。
発光を測定し、ルシフェラーゼ/GFP比を計算します。比率が低いほど、テスト分子による誤翻訳が減少していることを示します。
まず、2ミリリットルの7H9培地に細菌レポーター株を接種します。
摂氏37度で1〜2日間、または600ナノメートルのODが固定相に達するまで振とうします。
次に、50ミリリットルの7H9培地で継代培養し、600ナノメートルでのODが後期固定期に達するまで成長させます。細菌を96ウェルプレートに分注する前に、最終濃度50ナノグラム/ミリリットルのATCを加え、よく混合します。
ウェルあたり100マイクロリットルを、透明な丸底の96ウェルプレートに加えます。次に、選択したウェルに異なる用量の Ksg を追加して、誤訳率への影響をスクリーニングします。プレートのエッジウェルに200マイクロリットルの滅菌水を加えて、サンプルウェルからの蒸発を制限します。
プレートを密封し、振とうし、サンプルを摂氏37度で16〜20時間誘導します。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルから80マイクロリットルを取り出します。サンプルを黒底の96ウェルプレートに移し、ルミノメーターでGFPシグナルを測定します。
GFPシグナルを測定した後、プレートを3,220倍gで10分間遠心分離します。次に、50マイクロリットルの上清を白底の96ウェルプレートに移します。
次に、各ウェルに50マイクロリットルのNluc基質を加え、よく混合し、ルミノメーターで発光を測定します。最後に、補正されたNluc発光値をGFP蛍光で割ることにより、Nluc/GFP比を決定します。