細菌ワクチン抗原の構造的完全性を評価するためのウェスタンブロット

膜タンパク質-ナノリポタンパク質粒子からのタンパク質バンドを含むSDS-PAGEゲルを取ります。これらの複合体は、クラミジア感染に対する有望なワクチン抗原であるクラミジアオリゴマー膜タンパク質またはMPを運びます。

精製されたオリゴマーMPのタンパク質バンドをコントロールとして使用します。

ゲル、ウェスタンブロットメンブレン、およびブロッティング成分をドライブロッティングシステムで組み立てます。

電流を流して、分離されたタンパク質を膜に移します。

メンブレンを取り除き、界面活性剤と一次抗体を含む緩衝液でインキュベートします。

界面活性剤は非特異的相互作用部位をブロックし、一次抗体はMPを標的とします。

メンブレンを洗浄して、結合していない一次抗体を除去します。

一次抗体を標的とする蛍光色素結合二次抗体とインキュベートします。

メンブレンを洗浄して、余分な二次抗体を除去します。

メンブレンの蛍光画像をキャプチャします。

コントロールオリゴマーMPに一致する分子バンドは、複合体内のMPの構造的完全性を確認し、その抗原性を支持します。

SDS-PAGEでサンプルを分離し、ウェスタンブロット分析用の市販のドライブロッティングシステムを使用してゲルスタックを転写します。スタックからブロットを取り出し、0.2%TWEEN 20および0.5マイクログラム/ミリリットルMAb40、または0.2マイクログラム/ミリリットルMAbHIS抗HISタグ抗体を含むブロッキングバッファーで摂氏4度で一晩インキュベートします。

各ブロットをPBSTで3回、1回5分間洗浄します。蛍光色素に結合した二次抗体を含むブロッキングバッファーでブロットを1〜10,000の希釈液で1時間インキュベートします。PBSTで洗浄を繰り返し、最終洗浄後に蛍光イメージャーを使用して画像をキャプチャします。