光合成細菌からのプラストグロブレスの抽出と精製

光合成細菌であるシアノバクテリアの培養から始めます。

これらの細菌には、脂質が豊富なプラストグローブ液滴とチラコイド膜が含まれており、これらは光合成色素が豊富な折り畳まれた膜構造です。

培養物を遠心分離し、上清を廃棄して、細菌が産生する細胞外多糖類を除去します。ペレットを洗浄し、緩衝液に再懸濁します。

高圧ホモジナイザーを使用してせん断力を発生させ、細胞壁や膜を破壊します。

チラコイド膜の破裂により、光合成色素がライセートに放出されます。色素の放出は、細胞の破壊とプラストグロビュの放出を示す色の変化を引き起こします。

ライセートを遠心分離管にロードし、スクロース溶液を加えて密度勾配を形成します。

密度によって細胞成分を分離するための遠心分離機。

チラコイドやその他の重い成分は下部でペレット化し、低密度のプラストグロビュは明確なバンドとして上部に浮かびます。

プラストグロブ部分を収集し、さらなる分析のために凍結して保存します。

50ミリリットルのシネコシスチス種PCC 6802培養物をBG11培地で7〜10日間培養して、固定期に到達します。

分光光度計を使用して、セル密度を750ナノメートルで光学密度2.0に調整します。多糖類を除去するには、50ミリリットルの培養物を遠心分離し、上清を除去します。50ミリリットルのバッファーAで細胞の洗浄を2回繰り返します。

洗浄したペレットを25ミリリットルのバッファーAに再懸濁し、1,100ポンド平方インチのフレンチプレッシャーセルを使用して細胞を破壊します。白色光の下で溶解した色が緑色から赤青緑に変わるまで、低温条件でこのプロセスを3回繰り返します。細胞ホモジネートのアリコートを取り除き、代表的な全細胞サンプルとして保存するために取っておきます。

得られたホモジネートを、各チューブに最大2.5ミリリットルまで充填された8本の3ミリリットルの超遠心分離管に分配します。このホモジネートを400マイクロリットルの培地Rで重ね、ステップ勾配を生成します。チューブを遠心分離する前に、必要に応じて培地Rを追加して、チューブのバランスを慎重に調整します。

チラコイドおよびポリヒドロキシアルカノエート体を含む他のより重い細胞小器官はペレット形成を示しますが、プラストグロビュルはスクロース勾配の上部または近くに黄色の油性パッドを形成します。得られた粗プラストグロビュルの浮遊パッドを注射器で収穫し、収穫物を2ミリリットルのチューブに堆積させます。

必要に応じて、針先で超遠心分離管壁の側面からプラストグロビュルをこすり落とします。シアノバクテリア処理を続けるか、粗プラストグロビュルを摂氏マイナス80度で保存し、後で精製します。