極低温電子断層撮影のための レジオネラニューモフィラ の調製

病原菌である レジオネラ・ニューモフィラの培養から始めます。

これらの細菌細胞は、宿主感染に不可欠な膜上に分泌系を持っています。

細菌細胞を滅菌水中に懸濁して、極低温電子断層撮影(クライオET)イメージングに必要な密度を達成します。

3次元再構成中の画像アライメントの基準点として機能する金ナノ粒子を追加します。

穴あきカーボンフィルムを備えたグリッドを取り、細菌サンプルを堆積させます。

グリッドをガスで満たされたチャンバー内に置き、放電を加えて表面をより親水性にします。

懸濁液をグリッドに塗布し、液体が表面に均一に広がり、細胞が沈殿します。

グリッドから余分な水を取り除き、液体凍結培地に浸してサンプルを凍結し、その細胞構造を維持します。

これで、サンプルは細菌分泌系のクライオETイメージングの準備が整いました。

電子クライオトモグラフィーサンプルを調製するには、レ ジオネラ ニューモフィラの重いパッチを摂氏37度で48時間、CYE-寒天-ストレプトマイシンプレート上で増殖させます。

細胞を水中に約_{0.7のOD 600} に再懸濁します。次に、5マイクロリットルのコロイド金粒子を20マイクロリットルの細胞懸濁液に加えます。穴の開いたカーボングリッドをグロー放電し、その上に5マイクロリットルのセル混合物をピペットで入れます。

1分間放置します。グリッドをろ紙で吸い取り、重力駆動のプランジャー装置を使用して液体エタンで凍結します。