ビブリオナトリゲンからの粗細胞抽出物の調製

タンパク質合成速度の高いビ ブリオナトリゲンの懸濁液を冷却バッファーにして、細胞の分解を防ぎます。

低温条件下で遠心分離します。

上清を廃棄して汚染物質を除去します。

ペレットを少量の冷却バッファーに再懸濁します。

広口径のチップを使用して、懸濁液を微量遠心チューブに移し、機械的なせん断を防ぎます。

懸濁液を混合し、チューブを氷の上に置いたホルダーに入れます。

超音波処理器の先端をサスペンションに下げます。

超音波処理を開始して細胞膜を破壊し、細胞質内容物を放出します。

遠心分離機で不溶性細胞破片を分離します。

細胞質内容物を含む上清または粗細胞抽出物を新鮮なチューブに集めます。

細胞抽出物を液体窒素で瞬間凍結して、その生物活性を維持します。

無細胞タンパク質の発現にさらに使用するために、超低温で保存してください。

調製したばかりのS30溶解バッファーpH 7.7を摂氏約4度に冷却し、このコールドS30溶解バッファーを10ミリリットルを使用して、同じ1リットルの培養から得られたすべてのペレットを再懸濁し、懸濁液を50ミリリットルのチューブに移します。この懸濁液を摂氏4度で3,500倍gで10分間遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を吸引し、氷の上に置きます。

冷蔵室で作業し、氷の上に置かれた50ミリリットルのチューブ内のペレットに50マイクロリットルの冷S30溶解バッファーを加えます。広口径ピペットチップを使用してペレットを再懸濁し、同じく氷の上で2ミリリットルのチューブに慎重に移します。非常に活性な粗抽出物を製造するには、細胞がS30バッファーで過希釈されていないことを確認する必要がありますが、効率的な超音波処理に十分な液体が必要です。

600ミリリットルのビーカーに氷を入れ、氷の上に2ミリリットルのチューブホルダーを置きます。チューブを短時間渦巻きして細胞を均質化します。フリックしてキャップの底にある細胞を取り除き、キャップを開けた状態でチューブホルダーに入れます。

超音波処理器の先端をチューブ内の細胞懸濁液に下げて、液体表面のすぐ下になるようにします。超音波処理器と先端直径1/8インチのプローブを使用して超音波処理セットアップを準備します。ソニケーターを20キロヘルツの周波数と50%の振幅、10秒のパルスオン時間、60秒のパルスオフ時間に設定します。

パルス超音波処理プロトコルを3サイクル実行します。次に、粗細胞抽出物を摂氏4度で30〜45分間、16,000倍gで遠心分離し、溶解物に細胞破片がなくなるまで遠心分離します。

超音波処理が行われるときに細胞溶解を目視検査することは、超音波処理が期待どおりに機能したことを確認するために重要です。

冷蔵室で作業し、得られた上清の50マイクロリットルを新しい2ミリリットルのチューブに分注し、ペレットを乱さないように注意します。これらの粗細胞抽出物を瞬