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糸状シアノバクテリアである Phormidium lacunaの培養物を取ります。
培養物を均質化してフィラメントを分散させ、遠心分離して細菌をペレット化します。
上清を廃棄し、栄養豊富な培地にペレットを再懸濁します。
緑色蛍光タンパク質と抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドDNAを、抗生物質を添加した寒天プレートに加えます。
DNA上に細菌懸濁液を加え、光条件下でインキュベートします。
細菌はIV型線毛を使用してDNAを内在化します。導入された遺伝子は、細菌ゲノムの複数のコピーの1つに組み込まれます。
抗生物質を添加した寒天プレートに細菌を再分配して、形質転換された細菌を選択します。
光学顕微鏡下で、形質転換の成功を示す健康な緑色のフィラメントを特定します。
選択したフィラメントを抗生物質濃度の高い液体培地に移し、形質転換された集団を濃縮します。
繰り返しになりますが、形質転換体を分離するために、抗生物質レベルの高い寒天にそれらをプレートします。
蛍光顕微鏡でGFP発現を可視化し、形質転換の成功を確認します。
まず、50ミリリットルの液体F2培地を2つの250ミリリットルのフラスコのそれぞれに、実行中の培養物からの1ミリリットルの P.lacuna フィラメントを接種します。白色光で25°Cで約5日間撹拌して栽培します。
5日後、100ミリリットルの P.ラクナ 細胞懸濁液を10,000 RPMで3分間均質化し、750ナノメートルで光学密度を測定します。次に、細胞懸濁液を6,000倍gで15分間遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを800マイクロリットルの残りの液体と追加のF2 +培地に懸濁します。1ミリリットルあたり120マイクログラムのカナマイシンを含む8つのF2 +バクト寒天プレートを取り、各寒天プレートの中央に10マイクログラムのDNAをピペットで入れます。
すぐに100マイクロリットルの細胞懸濁液をDNAの上にピペットで移します。余分な液体を蒸発させるために、蓋なしで寒天プレートをクリーンベンチに置いてください。プレートを閉じて、摂氏25度の白色光で2日間栽培します。
2日後、各寒天プレートのフィラメントを、接種ループを使用して1ミリリットルあたり120マイクログラムのカナマイシンを含むいくつかの新鮮なF2 +バクト寒天プレートに分配します。プレートを摂氏25度の白色光で培養し、顕微鏡で定期的に培養物をチェックします。14〜28日後、死んだ茶色がかったフィラメントを特定し、顕微鏡下で変換されたフィラメントを探します。
変形したフィラメントは健康的で緑色に見え、大部分のフィラメントとは異なります。形質転換した各フィラメントを、1ミリリットルあたり250マイクログラムのカナマイシンを含む10ミリリットルのF2+培地を含む50ミリリットルのフラスコに移します。シェーカーで摂氏25度の白色光で栽培し、最大4週間成長を観察します。
フィラメントを1ミリリットルあたり250マイクログラムのカナマイシンを含む寒天培地に戻し、フィラメントが成長するのを待ちます。次に、カナマイシン濃度を再び上げて分離をスピードアップします。GFP発現については、蛍光顕微鏡で40倍または63倍の倍率で単一フィラメントを観察し、明視野透過像と蛍光像を撮影します。