相同組換えによるシアノバクテリアにおける抗生物質マーク変異体の生成

シアノバクテリアの培養から始めます。

培養物を遠心分離し、ペレットを優しく洗浄して細菌表面の線毛を保存します。

再度遠心分離し、ペレットを新鮮な培地に再懸濁し、チューブに移します。

抗生物質耐性遺伝子を持つ非複製ベクターを導入します。この遺伝子は、細菌ゲノムの標的遺伝子の上流および下流に位置する領域と相同なDNA配列に隣接しています。

インキュベートしてプラスミドの菌株を介した内在化を可能にし、プラスミドは相同配列と整列し、組換えによって標的遺伝子を置換し、それによって変異を導入します。

細胞を寒天に広げてインキュベートし、抗生物質耐性遺伝子が耐性タンパク質を発現できるようにします。

抗生物質を含む寒天で寒天表面を重ね、インキュベートします。変異細胞の耐性タンパク質は抗生物質を不活性化し、抗生物質の生存とコロニー形成を促進します。

生き残ったコロニーを選び、抗生物質を含む寒天培地に再縞模様を付けて、抗生物質耐性変異体を分離します。

培地、シアノバクテリア株、およびプラスミドを調製した後、テキストプロトコルに従って、シアノバクテリア細胞でいっぱいのループを30〜50ミリリットルのBG11培地に接種することにより、新鮮な培養物を設定します。

摂氏30度の光の下で2〜3日間、OD₇₅₀ が0.2〜0.6に等しい培養物を成長させます。

インキュベーション後、1〜2ミリリットルの培養物を2,300 gで5分間遠心分離します。次に、上清を廃棄した後、ボルテックスによりDNA取り込みに不可欠な線毛が失われる可能性があるため、BG11培地を使用してペレットを一度洗浄し、穏やかにピペッティングして細胞を再懸濁します。

細胞を再度ペレット化し、上清を除去した後、BG11培地を最終容量100マイクロリットルまで添加し、細胞を14ミリリットルの丸底チューブに移します。次に、事前に調製したプラスミドAを1マイクログラムを細胞に加え、軽くたたいて混合します。

次に、チューブを摂氏30度のインキュベーターに水平に置き、4〜6時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞培養プラスミドDNA混合物のアリコートを抗生物質を使用せずにBG11寒天プレートに広げ、摂氏30度でインキュベートします。

約24時間後、カナマイシンを含む水に0.6%寒天溶液を調製し、摂氏42度まで冷まします。次に、培養プレートの端に2.5〜3ミリリットルを加え、プレートを傾けて、溶液が表面に均一な上部寒天層を形成するようにします。

コロニーが見えるようにプレートを約7日間インキュベートします。次に、新鮮なBG11寒天とカナマイシンプレートを6つのセクターに分割し、鈍い端のつまようじを使用して個々のコロニーを縞模様にします。