Name: マウスにおけるモデリングのストローク - フィラメントモデルと中大脳動脈閉塞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 学ぶマウス脳卒中モデル作成法。フィラメントを用いた中大脳動脈閉塞により、虚血性脳卒中と神経学的欠損を再現します。熟練した術者は約10分で実施でき、行動変化と組織学的解析で評価可能です。

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この作品は、補助金協定nー201024とN ° 202213（欧州脳卒中ネットワーク）の下で欧州共同体の第七次フレームワーク計画（FP7/2007-2013）によって賄われていた。今回調達した資金は、BundesministeriumこだわりBildungウントForschung（脳卒中研究ベルリンセンター）、およびドイツ学術振興（Exzellenzcluster NEUROCURE）​​によって与えられた。 著者は、アニメーションを生成するための操作とエルケルートヴィヒ（シャリテビデオサービス）の間にサポートのためにMareike Thielkeを（実験的神経用Dep.、シャリテベルリン）に感謝いたします。

高い品質と再現性を保証するために、我々は、標準作業手順（SOP）の使用をお勧めします。このビデオでは、当研究室で開発し、使用されるなど、公開された標準操作手順書（SOP）が適用されます1。 1。大脳動脈閉塞<ol><li>マウスは、獣医スタッフに相談に適切な麻酔薬体制で麻酔です。 （1.5例：誘導 - 1.0 2％イソフルランおよびメンテナンス - 2 / 3 N2Oと気化器を使用して3分の1 O2におけるイソフルラン1.5％）。 <ol><li>マウスの体温は36.5℃で± 0.5℃の加熱プレートと手術中に維持されます。マウスの直腸温に応じて温めフィードバック制御された加熱パッドは、強くお勧めします。 </li><li>適切なエージェント（例えば70％エチルアルコール）を皮膚と周囲の毛を消毒し、その後、それを乾燥させてください。 </li></ol></li><li>正中首の切開が行われ、軟組織を離れて引っ張られている。 </li><li>左総頸動脈（LCCAは）慎重に周囲の神経（迷走神経に悪影響を及ぼすことなく）と結紮が6.0/7.0文字列を使用して作られているからフリー解剖される。 5.0文字列を使用することもできます。 </li><li>左外頸動脈（LECAが）その後、分離され、第結び目が行われます。 </li><li>次に、左内頸動脈（LICA）が隔離され、結び目は6.0フィラメントを用いて製造されています。 </li><li>左内頸動脈（LICA）と左の翼口蓋動脈（LPA）の良いビューを取得した後、両方の動脈は血管クリップを使用して、クリップされます。 </li><li>それはLECAとLICAに分岐する前に小さな穴がLCCAにカットされます。それは、クリップで止まるまで、シリコンの硬化剤の混合物（下記参照）でコーティングされた8.0ナイロン製モノフィラメントは、その後、LICAに導入される。注目は、後頭動脈を入力しないように支払われる必要があります。 （図1） </li><li>フィラメントは、ウィリス動脈輪におけるLMCAの起源を閉塞するLICAに挿入されている間クリッピング動脈が開かれます。 </li><li> LICAのサード結び目は位置にフ​​ィラメントを修正するために閉じている。 </li><li>マウスは、皮下のボリューム補充として生理食塩水0.5mlを受け取る。鎮痛のために、リドカインゲルを局所的に創傷に適用されます。 </li><li>再灌流が意図されている場合は、マウスが30のために滞在 - 温水ケージで90分の閉塞、傷が小さい縫合クリップで閉じることができる。その後、第二麻酔が行われ、ICAのサード結び目は瞬間的に開かれ、フィラメントが引き出される。 </li><li>残りの縫合糸が短縮され、皮膚は外科用縫合糸で構成されている。 </li><li>すべての動物は、上記のように2番目のボリューム補充を受ける。 </li><li>動物は、体温をコントロールするために2時間加熱したケージに入れています。 <ol><li>動物は不快の徴候のための手術後に毎日チェックする必要があります。マウスはいくつかの術後の体重減少を示すことができる。彼らは食べることを奨励するために床に置かれたシャーレでつぶした食べ物を受け取ります。食品は7日間毎日置き換えられます。 </li></ol></li></ol> 2。偽手術<ol><li>偽の操作のためにフィラメントがLMCAを閉塞するために挿入し、インスタント再灌流（1.8）を可能にするために直ちに撤回されている。第二麻酔を含めて - その後の操作は、脳虚血（1.14 1.9）受けている動物で実行されるのと同じです。 </li></ol> 3。フィラメントの調製<ol><li>フィラメントの無菌性を考慮する必要があります。滅菌装置だけでなく、フィラメントの適切​​な取扱いの使用は、その後無菌手術のための前提条件です。フィラメントの消毒は、一般的な滅菌法の多くは、フィラメントの品質を悪化させる可能性があるので、難しいです。しかし、放射線などのメソッドは、UV光またはγ線、または化学滅菌で、例えば、エチレンオキサイドのような高度に反応性ガスと、例えば、適用可能です。 </li><li> 8.0ナイロンフィラメントは、顕微鏡下で11mmの長さに切断され</li><li>フィラメントの先端はXantopren M粘膜とアクティベーターNF Optosilの硬化剤の混合物と8mmの長さにわたって完全に均等にコーティングする必要があります。 </li></ol> 4。代表的な結果異なる運動や行動障害の結果は、血流制限の持続時間に応じて。脳虚血の30〜60分後にはどちらも、ほとんどの場合動物は横方向プッシュ対する抵抗の減少を示し、運動の障害に起因する旋回。前里の屈筋の位置などの軽度病変のマニフェストMBS。これらを簡単に観察可能な標識は、操作の成功のための基本的なスコアとして使用することができます。2 形態学的病変は、組織や磁気共鳴イメージング（MRI）のいずれかを用いて評価することができる。虚血の30分は、線条体に限定、主に神経細胞死を引き起こすのに対し、中大脳動脈の閉塞60分は、線条体と新皮質の両方を含む領域に組織pannecrosisを生成する。3（図2）梗塞体積の面では、我々は期待する一連のオペレーションの30％未満の標準偏差低い。 60分後に20％ - 死亡率は、虚血および10の30分後に約5％の閉塞時間によって異なります。 別の最小限の侵襲の可能性は、その成功の直接制御を可能にする動作時のレーザードップラーフローメトリー（LDF）の使用です。個々の動物、10〜削減で- preocclusion値の20％は明らかに局所的脳虚血の正常な誘導を示している4 LDFだけ血液の量的変化を（パーセンテージで）測定できるので、しかし、LDFは、個体間比較の方法として使用することはできません。小さいと限定された組織サンプルボリューム内の流れ。それは血流の減少の空間的な範囲についての情報を与えるものではありません5。 歩行分析6,7、ロータロッド8、ポールテスト9,10、接着剤除去試験11,12、階段のテスト13,14、ラダーのラングのテスト15,16とモリス水迷路を含む脳卒中後の行動的側面 ​​を評価するには、いくつかのテストが、あります。 17。すべてのこれらのテストでは、MCAOにさらさマウスは少なく、正常対照動物より行います。 <img src="/files/ftp_upload/2423/2423fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> マウスの脳を供給する血管のアーキテクチャの図は、1。スキーム（バックグラウンドに描かれた）。異なる株は、例えば、後頭動脈はしばしば内頸動脈から離れ、バリエーションが表示されることがあります。 <img src="/files/ftp_upload/2423/2423fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。近MCAOモデルにおける再灌流の異なる時間点後の典型的な病変の大きさの模式図。途中で、機能的活動とMCAO後の脳血流の典型的なコースが描かれている。 （MCAO：中大脳動脈閉塞、LDF：レーザードップラー血流量測定）

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<li>Macleod, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+laboratory+practice%3A+preventing+introduction+of+bias+at+the+bench%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Good laboratory practice: preventing introduction of bias at the bench.</a> Stroke. 40, 50-52 (2009).</li>
<li>Group, S. T. A. I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+standards+regarding+preclinical+neuroprotective+and+restorative+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Recommendations for standards regarding preclinical neuroprotective and restorative drug development.</a> Stroke. 30, 2752-2758 (1999).</li>
</ol>

動物実験はLandesamt福二お大事にウントSoziales、ベルリン、ドイツで定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。

一過性のモデルは、ここで紹介する近位MCA閉塞18,19は、患者の虚血性脳卒中の最も一般的なタイプのいずれかを模倣する。20は変数の再灌流時間に基づいて、モデルは、一過性脳虚血発作（TIA）から大型まで被害の異なるグレードを提供しています虚血半球の主要な部分を含む梗塞。これは、脳卒中後の研究者がさまざまな病態生理学的メカニズムを研究することができます。20,21 手術は短時間で行われ、再現性の高い病変を生成することができます。それにもかかわらず、これは交絡因子の徹底したコントロールを必要とする。運用テクニック22小さな違いが梗塞に異なった効果を説明しうる。さらに23,24、脳血管解剖の分散のために、異なるマウス系統は、異なる結果を示す。25,26ボディを温度がより小さい病変27、より重度の障害に温熱療法につながる低体温で、神経学的損傷に影響を与えます。28したがって、温度制御やメンテナンスが、このモデルでは、関連性の高いです。加えて29血圧と血液ガスの結果の重要な交絡因子であるとする必要がある監視される。迅速かつ最小限の侵襲的な方法（非侵襲的血圧測定、適切かつ容易にアクセス可能な採血部位）の30,31の使用は推奨されます。いくつかの神経保護効果を持っている、および/ ​​または血管拡張薬となる可能性があるため、麻酔薬の選択はイソフルランなどのように、、また非常に重要である。そのため32、麻酔への曝露が可能と標準化されただけ短くしてください。我々は、より長い15分間の手術を受けた動物を除外する。 手術部位をシェービングすることmicroabrasionsと炎症を生成し、髪のフラグメントを解放します。これにより、さらに炎症を増加させ、脳卒中病態に影響を与える可能性があるローカル感染を、促進することがあります。住宅の条件、濃縮の特に使用は、脳卒中転帰に影響を及ぼす可能性がありますし、標準化と研究の報告書に記載されている必要があります。再現性で環境エンリッチメントとその効果の6,33,34使用は議論の問題である。35もう一つの重要な交絡因子がある追加の罹患率と死亡率の増加につながる特に虚血36の長い時間の後に感染の脳卒中誘発される危険性、。37,38感染症は5〜約3日目での症状のようになると、これはそのようなモデルでのフォローアップ長期的に重要な影響をもたらします。 脳卒中、標準化と品質管理のために新たな治療戦略の開発に関連する結果を生成するには、前臨床トランスレーショナルストロークの研究で非常に重要である39&quot;優良試験所&quot;40,41義務付けては。： <ol><li>使用する動物の適切かつ詳細な説明; </li><li>期待される効果の大きさのサンプルサイズの計算とレポート作成; </li><li>試験前に設定した選択基準と除外基準、; </li><li>グループへの割り当てのランダム化。 </li><li>研究者に関して割付けの隠蔽; </li><li>分析から除外動物を報告。 </li><li>結果の盲検評価; </li><li>関心と研究の資金の潜在的な競合を報告。 </li></ol>

<table><tbody><tr><td>外科用剪刀（皮膚切開用）</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumontピンセット 2本（Medical #5 ストレートチップ）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>スプリングシザー（Vannas型）</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>マイクロクランプ用適用ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>微小血管クランプ（例：S&amp;amp;G B1-V）</td><td>Fine Science Tools</td><td>00396-01</td><td>Serrefineでも代用可能</td></tr><tr><td>Hartmann型止血鉗子 2本</td><td>Fine Science Tools</td><td>13002-10</td><td></td></tr><tr><td>持針器（Olsen-Hegar型またはその他）</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>標準解剖学的ピンセット（創閉鎖用）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>5/0 縫合糸</td><td>Suprama</td><td></td><td>血管結紮用</td></tr><tr><td>6/0 縫合糸</td><td>Suprama</td><td></td><td>皮膚縫合用、5/0でも代用可能</td></tr><tr><td>リドカイン（例：キシロカインゲル 2%）</td><td>AstraZeneca</td><td></td><td>またはその他の局所麻酔薬</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡（実体顕微鏡）、倍率 6x～最大 40x</td><td>Leica Zeiss</td><td>MZ6 Stemi2000C</td><td></td></tr><tr><td>冷光照明装置</td><td>Leica Microsystems</td><td>KL1500</td><td></td></tr><tr><td>温度フィードバック制御式加熱パッドシステム</td><td>Fine Science Tools</td><td>21052-00</td><td>マウス用パッドおよび小型プローブ付き</td></tr><tr><td>イソフルラン用麻酔システム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Abott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>動物用回復チャンバー</td><td>Peco Services</td><td>V1200</td><td>加温ケージ</td></tr><tr><td>8.0 ナイロンフィラメント</td><td>Suprama</td><td>TEL181005</td><td>コーティング用</td></tr><tr><td>メス</td><td></td><td></td><td>フィラメントを断片に切断するため</td></tr><tr><td>定規</td><td></td><td></td><td>フィラメントを適切な長さに切断するため</td></tr><tr><td>Xantopren M Mucosa</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activator Universal Plus</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>Optosil - Xantopren</td></tr><tr><td>Dumontピンセット 2本（Medical #5 ストレートチップ）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>未コーティングのフィラメントを保管・把持するための柔らかい下敷き</td><td></td><td></td><td>例：綿球、フォーム、&amp;#8230;</td></tr><tr><td>作製済みフィラメント用容器</td><td></td><td></td><td>例：シャーレ、柔軟性フォーム、&amp;#8230;</td></tr></tbody></table>

マウスにおけるモデリングのストローク - フィラメントモデルと中大脳動脈閉塞

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

ストロークは、特に先進国では、死と成人の障害の最も一般的な原因のひとつです。しかし、現在までの治療の選択肢は非常に限られています。新たな治療アプローチの必要性を満たすために、実験的脳卒中の研究は、しばしば局所脳虚血の齧歯類モデルを採用しています。ほとんどの研究は、マウスやラットにおける中大脳動脈（MCA）の永続的または一時的な閉塞を使用してください。 腔内縫合のテクニック（そのフィラメントまたは糸のモデルと呼ばれる）を介して中大脳動脈（MCA）の近位閉塞は、おそらく実験的脳卒中研究において最も頻繁に使用されるモデルです。腔内MCAOモデルは、比較的非侵襲的な方法でMCA領域の再現性の一時的または永続的な虚血を誘導するという利点があります。腔内のアプローチは、この動脈の全体領土の血の流れが中断される。フィラメント閉塞は、このように逮捕者は、大脳基底核を供給lenticulo - 線条体動脈、近位に流れます。フィラメントは、皮質と線条体における再現性の病変でMCAの結果の閉塞と永久的または一時的のどちらでもかまいません。対照的に、遠位誘導モデル（lenticulo - 線条体動脈の分枝には）MCA閉塞は、通常、線条体を惜しまないし、主に新皮質を含む。さらに、これらのモデルはクレイニエクトミを必要としません。この記事で紹介モデルでは、シリコンコーティングされたフィラメントは、総頸動脈に導入され、それが中大脳動脈の起源をブロックウィリスのサークルに内頸動脈に沿って進んだ。患者では、中大脳動脈の閉塞は虚血性脳卒中の最も一般的な原因の一つです。虚血の間隔を変化することは再灌流の時点に応じて、このモデルでは自由に選択できるので、重要度の度合いも異なる虚血性病変を製造することができる。吸蔵フィラメントの除去は、少なくとも部分的にモデルヒトの血栓塞栓血栓の自発的または治療因子（tPA）溶解後の血流の回復によって再灌流。 このビデオでは、基本的なテクニックだけでなく、このモデルの予測値を制限することが主な落とし穴と交絡因子を提示する。

中大脳動脈の糸状閉塞は、マウスでは虚血性脳卒中を研究するための一般的なモデルです。

脳卒中は、特に先進国において、死亡および成人における障害の最も頻度の高い原因の一つとなっています。しかしながら、今日までの治療 options は...

この手順の全体的な目的は、管腔内スレッドを用いて中大脳動脈を遮断することにより、局所性脳虚血のマウスモデルを作製することです。これは、頸部の正中切開を行い、総頸動脈を視認することで達成されます。次のステップとして、総頸動脈を結紮し、外頸動脈クランプを使用してそれらを固定し、出血を防止します。手順の最終ステップは、フィラメントをウィリス動脈輪に挿入することです。これにより中大脳動脈の分枝が遮断され、最終的に神経学的欠損が生じます。その結果、行動の変化を観察することで閉塞を確認することができます。フィラメント法による近位中大脳動脈（MCA）閉塞の主な利点の一つは、線条体および皮質において再現性の高い病変を作製できることです。虚血は永続的または一過性に導入することができ、さらに、開頭術を必要としないため、フィラメントによるMCA閉塞はおよそ非侵襲的な手法であると考えられています。一般的に、この手法に不慣れな者は、マイクロサージェリー技術の繊細さゆえに困難を伴うことがあります。処置に先立ち、顕微鏡下で8.0ナイロンフィラメントを11 mmの長さに切断し、フィラメントを準備します。フィラメントの先端8 mmの長さにわたって、シリコン混合物で完全かつ均一にコーティングする必要があります。最適な結果を得るためには、標準作業手順書（SOP）に従うことが推奨されます。使用するマウスの種類は、研究の目的に応じて選択します。一般的に、マウスは10週齢以上である必要があります。獣医スタッフと協議の上、適切な麻酔剤を使用してください。手術中はヒーティングプレートを用いてマウスの体温を約36.5 degrees Celsiusに維持し、手術部位を準備して皮膚と周囲の被毛を消毒し、乾燥させます。頸部的に正中切開を行い、軟部組織を優しく広げます。左総頸動脈を慎重に剥離し、迷走神経を傷つけないように周囲の神経から分離させた後、5.0から7.0の縫合糸を用いて結紮します。次に、左外頸動脈を単離し、2つ目の結紮を行います。続いて左内頸動脈を単離し、その周囲をゆるく結紮します。6.0のフィラメントを用い、結紮（けっさく）は手順の後半で行います。左内頸動脈と左口蓋蓋動脈が十分に視認できたら、フィラメント挿入の準備として両動脈をECクリップで遮断します。分枝する前の総頸動脈に小さな穴を開けます。先に準備したモノフィラメントを動脈内に挿入します。フィラメントを内頸動脈に挿入しながら、クリップで留めていた動脈を開放します。中大脳動脈を閉塞させるため、内頸動脈上の3番目の結び目を締めます。フィラメントを固定し、痛みを軽減させるために傷口にリドカインゲルを局所的に塗布します。偽手術では、フィラメントを挿入して直ちに引き抜き、即時の再灌流を可能にします。また、体積補充として0.5 millilitersの生理食塩水を皮下に投与します。再灌流の効果を調べるには、3番目の結び目を解いてフィラメントを取り除きます。虚血後、通常は30分から60分後の設定時間をおいて再灌流を行います。この例では、閉塞後60分に再灌流を行い、2回目の生理食塩水による容量補充注入を行います。最後に、残りの縫合糸を短くし、外科用縫合糸で皮膚を閉鎖します。動物を温熱ケージに入れ、手術後の回復のために2時間静置し、不快感の兆候がないか毎日確認します。術後には体重減少が起こる可能性があるため、摂食を促すために、ペトリ皿に入れたマッシュフードをケージの床に設置してマウスに提供してください。餌は7日間、毎日交換します。血流制限の時間は、運動および行動障害の差につながる可能性があります。脳虚血後30分または60分で、ほとんどの動物に抵抗性の低下が見られます。歩行障害による後肢の押し出し（プッシュ）や円を描くような歩行（サークリング）が見られ、より軽度の病変では前肢が屈曲した状態で現れます。これらの容易に観察可能な徴候は、手術の成功度を判定するための基本的なスコアとして利用できます。得られた病変は、組織学的検査または磁気共鳴画像法（MRI）を用いて評価することが可能です。ここで示されているように、中大脳動脈を60分間閉塞させると、線条体と皮質の両方を含む領域に組織の汎壊死が生じますが、30分間の虚血では、主に線条体に限定された神経細胞死が引き起こされます。熟練したMCAO術者は、10分でこの手技を習得することができます。本処置を行う際は、再現性のある結果を確保し、共変数を制御するために、標準作業手順書に従うことが重要です。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

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マウスにおけるモデリングのストローク - フィラメントモデルと中大脳動脈閉塞

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