環境サンプルから内胞子を植物細胞の標的溶解による分離

胞子形成細菌の栄養細胞と内胞子を含む環境サンプル、他の細菌を採取します。

内胞子は過酷な環境でも生き延びるための保護被毛を持っています。

真空ろ過装置を用いて、サンプルをろ過して細胞と内胞子を膜に捕捉します。

膜を皿に入れて小さく切ります。

細胞片をチューブに移し、バッファーを加えてチューブをかき混ぜて細胞や内胞子を放出します。

高温で攪拌しながら培養し、内胞子を傷つけずに栄養細胞の構造を弱めます。

サンプルを冷やし、リソザイムを加えて攪拌しながら培養します。リゾザムは栄養細胞の細胞壁を破壊し、細胞を破裂させます。

水酸化ナトリウムと洗剤を加え、細胞の高分子やゴミを分解しつつ、強靭な内胞子を保存するために培養します。

サンプルをろ過して内胞子を分離してください。内胞子を洗浄して余分な試薬を除去し、さらなる分析に備えます。

テキストプロトコルに従ってろ過ユニットと真空ポンプが準備されたら、エタノール火を吹き付けた滅菌鉗子を使って、ろ過ユニットに無菌のニトロセルロース膜を追加します。準備したばかりの上澄液サンプルの半分を膜ろ過装置に加え、真空ポンプで膜上の細胞を採取します。液体がフィルターを完全に通過したら、真空ポンプを停止します。

滅菌された鉗子を使って膜を慎重に取り除き、無菌のペトリ皿に入れます。新しい滅菌膜の片を使い、残りの半分の溶液でろ過を繰り返します。集めたばかりのバイオマス中の栄養細胞から内胞子を分離し、凍結していた膜を解凍し、エタノール炎で滅菌したハサミで小さな破片に切り分けます。

膜片を滅菌2ミリリットル管に移し、1X TEバッファーを900マイクロリットル追加します。ボルテックスで十分に混ぜて膜からバイオマスを放出します。チューブは65度・80回転で10分間孵化します。

その後、チューブをインキュベーターから取り出し、15分間冷ます。新たに調製したリソザイムを100マイクロリットルを加え、最終濃度は1ミリリットルあたり2ミリグラム、サンプルを37度・80回転分の状態で60分間培養して栄養細胞を溶解します。溶解が完了した後、3種類の通常の水酸化ナトリウム250マイクロリットルと6%SDS溶液250マイクロリットルを加えます。室温で80回転で60分間培養します。

次に、直径25ミリメートルの膜を固定する無菌ろ過装置を自動クレーブで準備します。ろ過ユニットが冷却された後、直径25ミリメートルの0.2マイクロメートルのニトロセルロース膜をその上に貼ります。

サンプルを膜に加え、真空ポンプで液体をろ過し、膜上の内胞子を捕捉しつつ、栄養細胞物質が通過します。