大腸菌における蛍光標識リプレッサーによるタンパク質媒介複製阻害

遺伝子操作された大 腸菌 培養で染色体テトラサイクリンオペレーター(tetO)アレイを発現させた例を考えてみましょう。

また、細菌はアラビノース誘導性プロモーターを持つプラスミドを保有しており、これがYFP標識されたテトラサイクリン抑制タンパク質の発現を促します。

培養液を抗生物質を含む濃縮栄養培地に移し、振って培養してプラスミド保有細胞を選定します。

細胞が成長するにつれて、レプリソームが形成され、染色体DNA複製が始まります。

指数位相では、誘導されていない制御の一部を収集します。

残った培養に誘導剤であるアラビノースを加え、両方の培養をシェイピングで培養します。

誘導培養中では、AraCダイマーがDNAループに結合したまま、リプレッサー発現を抑制します。

誘導培養では、アラビノースがAraC二量体に結合し、リプレッサー発現を誘導します。

リプレッサータンパク質は染色体TetOアレイに結合し、複製フォークの進行を停止させます。

蛍光顕微鏡を使って両方の培養を観察してください。

誘導された 大腸菌 培養中の蛍光焦点は、リプレッサーによるタンパク質介在の複製遮断を裏付けています。

この手技には、pKM1プラスミド中にテトラサイクリンオペレーターアレイを持つ 大腸菌 株が用いられます。pKM1は、誘導性の黄色蛍光タンパク質標識テトラサイクリン抑制タンパク質であるTetR-YFPをコードしています。

この大 腸菌 株の新鮮な一晩培養液を、選択に必要な抗生物質を使った希薄な複合培地で、600ナノメートルの0.01の光学密度に希釈します。培養液を30度Cで振って600ナノメートルの光学密度0.05から0.1に増殖させます。誘導しない対照として10ミリリットルのサンプルを採取します。

残った培養に0.01%のアラビノースを加え、pKM1からTetR-YFPの産生を誘導します。誘導培養と誘導培養の両方を30度の温度で揺らしながら増殖を続けます。1時間後、蛍光顕微鏡を用いて誘導培養の各細胞内に単一の焦点点が存在するかどうかを確認します。

誘導細胞がブロックされていることが確認され(70%以上が単一の焦点を持つことを示す場合)、光学密度を記録し、7.5ミリリットルのサンプルを採取して二次元ゲル電気泳動で分析します。誘導しない対照培養から同等のサンプルを採取します。