細菌遺伝子検出のためのループ媒介等温増幅

鎖置換DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、そしてループ媒介等温増幅(LAMP)用の二本鎖DNA結合染料を含むマスターミックスを考えましょう。

標的細菌遺伝子に特異的な逆相補配列を含むプライマーを加えます。

マスターミックスをチューブに分配します。

細菌DNAテンプレートを含むサンプルをチューブに追加します。

チューブをLAMP機器の中に入れます。

初期変性によりプライマーは標的DNAに結合します。

鎖を置換するDNAポリメラーゼが新しい鎖を合成し始めると、既存の鎖を置換し、熱循環の必要性を排除します。

増幅された積は逆相補対によりループ構造を形成します。

この構造は次のサイクルのための複数の開始部位を含み、標的DNAの指数関数的増幅を促進します。

この染料は増幅されたDNAに結合し、蛍光を放出します。

蛍光をリアルタイムで監視し、サンプル中の標的細菌遺伝子の存在を検出します。

LAMPマスターミックスの準備とDNAテンプレートの追加に使われる部分を物理的に分けてください。

作業面をイソプロパノールとDNAおよびDNase分解液で洗浄してください。その後、ピペットとチューブストリップホルダーを清掃します。等温マスターミックス、10倍プライマーミックス、分子グレードの水、ポジティブコントロールDNA、DNAテンプレートを室温で解凍します。

LAMP計測器をオンにし、該当するサンプル情報を入力してください。原稿の指示に従ってLAMPマスターミックスを準備し、短時間でボルテックスして遠心分離し、チューブストリップの各ウェルに23マイクロリットルのマスターミックスを分散します。すべてのDNAテンプレートを渦巻き、短時間遠心分離機をかけてください。

次に、適切な井戸に2マイクロリットルのDNAテンプレートを加え、井戸をしっかりと蓋を閉めます。チューブストリップをホルダーから外し、試薬がチューブの底に溜まっているか確認するために弾きます。チューブストリップをLAMP機器に装填し、LAMPランを開始します。

LAMP反応中は、温度、増幅、アニールのタブをタップして、LAMP実行中のさまざまなパラメータの動的変化を確認してください。