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まずは、成長の遅い土壌細菌である ミクソコッカス・ザンサスの培養から始めましょう。
抗生物質を補った培地にコロニーを接種します。
細胞は抗生物質に耐性を持つように設計されており、望ましい細菌だけが生き残るようにされています。
懸濁液を培地を入った大きなフラスコに移し、振動しながら培養して最適な成長を促進します。
金属フレームに取り付けられたカバースリップを例に取ると、画像撮影時に機械的サポートを提供します。
細菌培養液をその上に分散し、複数の画像を取得する際に画像の照準基準として蛍光微球を追加します。
培地を温めておいたアガロースパッドを敷き、その上にカバースリップを重ねて水分補給を保ちます。
細胞がアガロースパッドに付着できるように培養します。
このパッドは細胞に栄養を供給し、増殖の遅い細菌の増殖過程を長期的に生きた細胞で画像化することを可能にします。
まず、1%CTTを500マイクロリットルに1%CTTを添加し、抗生物質を補給して無菌チューブ内に再懸濁し、全懸濁液を5ミリリットルの1% CTT入り50ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコに移します。0.2%CTTを含む1%アガロース顕微鏡溶液を、アガロース1グラムと80ミリリットルのTPMバッファーおよび20ミリリットルの1%CTT培地を混合して準備します。溶液を電子レンジで加熱し、アガロースが溶けるまで加熱します。
ペトリ皿に約60ミリリットルの溶けたアガロースを入れ、室温まで冷ます。使用前にアガロースパッドを32度で少なくとも15分間予温めてください。次に、中央に穴の開いたプラスチックまたは金属のフレームに滅菌ガラスのカバースリップを貼ります。その後、テープでカバースリップをフレームに固定します。
カバースリップに指数関数的に増殖した M. xanthus 細胞を10〜20マイクロリットル追加します。蛍光微小球を細胞のフィデューシャルマーカーとして追加するには、TPMバッファーを使って微小球を1:100に希釈します。ビーズ懸濁液をよく振って、セルに5〜10マイクロリットルを加えます。
大きな予熱済み1%アガロースパッドから、カバースリップほどの大きさの小さなパッドを切り取り、細胞の上に置きます。その後、パッドの上にカバースリップを敷いて蒸発を防ぎ、細胞を湿った環境に保ちます。顕微鏡サンプルを32度Cで15〜20分間インキュベートし、細胞がアガロースパッドの底に付着するのを待ってからタイムラプス顕微鏡の記録を行います。