モデルタンパク質の熱展開による細菌シャペロン活性の評価

まず、温度制御可能なキュベットホルダーと攪拌器を備えた蛍光分光光度計にキュベットを置きます。

中程度の酸性pHで予備加熱済みバッファーを加え、ホルダーの温度を応力条件を模して設定します。

試験サンプルには大 腸菌由来の酸保護シャペロンを加えます。

対照試料では、同じ量のバッファーを追加します。

次に、両方のサンプルに温度と酸に敏感な基質タンパク質を導入します。

光の散乱を監視し始めてください。

試料をストレス条件下でキュベートし、基質の展開を誘導します。

中程度の酸性pHでは、シャペロンが活性化し、折りたたまれていないタンパク質を安定化させます。

pH中和塩溶液を加え、光の散乱を記録し続けます。

対照試料では、中性pHに戻ることで折りたたみのないタンパク質が集まり、光の散乱が増加します。

試験サンプルでは、シャペロンが基質の再折りたたみを促進し、対照群に比べて光の散乱が減少します。

光散乱信号を比較してシャペロン活性を評価してください。

1ミリリットルの石英キュベットを、温度制御されたサンプルホルダーと攪拌器を備えた蛍光分光光度計に入れます。

励起波長と放出波長を350ナノメートルに設定します。所定のpH値で適量の予備加熱バッファーDをキューベットに加えます。総体積は1,000マイクロリットルです。

キューベットホルダーの温度を43度に設定します。バッファーに12.5マイクロモルのHdeBを加え、その後0.5マイクロモルのMDHを加えます。光の散乱を監視し始めてください。

反応を360秒間培養し、MDHの十分な展開を可能にします。2モルの無バッファーリン酸二カリウムを0.16から0.34の体積に加え、pHを7に上げ、さらに440秒間光の散乱を記録し続けます。テキストプロトコルで説明されたデータを解析します。