病原性細菌からの熱分解ベースのゲノムDNA抽出

まずは栄養豊富な寒天培地上で培養した病原性細菌のコロニーから始めます。

単一のコロニーを選択することで、細菌細胞の遺伝的に均質な集団が確保され、遺伝子型付け時の変動が減ります。

無菌接種ループを用いて、選ばれたコロニーを超純水に移し、サンプルへの汚染物質侵入リスクを最小限に抑えます。

浮遊液を渦巻き、コロニーを破壊し、細菌細胞を均一に分散させます。

次に、懸濁液を加熱して細菌の細胞膜(外膜、ペプチドグリカン層、内膜からなる)を破壊します。

これにより細菌細胞は溶解し、ゲノムDNAを含む細胞内内容物を水中に放出します。

高速で遠心分離して細胞の残骸をゲノムDNAから分離します。

上清液を新しいチューブに移し、下流のジェノタイピング適用に備えます。

まず、無菌接種ループを使って、適切な寒天タイプに Yersinia ruckeri 純菌を培養皿にまきます。22度で1〜2日間、または15度で3〜4日間孵育します。その後、接種ループを使って各ペトリ皿から代表的なコロニーを1つ選び、1.5ミリリットルの遠心分離機管に移し、50マイクロリットルの超精製水を詰めて再懸浮させます。

ボルテックスは短時間、100度の加熱ブロックで7分間孵化します。その後、16,000gで3分間遠心分離機にし、ピペットを使って上清型DNAを空の1.5ミリリットル遠心分離機管に慎重に移します。次のステップに進むか、DNAをマイナス20度の温度で保存してください。