病原性細菌に感染した植物の葉組織からゲノムDNAを抽出する

病原性細菌である Candidatus liberibacter に感染した葉を例に取ってください。

それを細かく切り、液体窒素で急凍し、挽いて植物の細胞を破裂させ、その内容物(細菌を含む)を放出します。

核溶解バッファーを加え、十分に混ぜます。

高温で培養して膜を溶解し、植物核や細菌細胞からゲノムDNAを放出します。

RNase酵素を加え、チューブを逆さまに混ぜてから培養し、RNAを分解します。

タンパク質沈殿液を加えて混合し、タンパク質の凝集を促進します。遠心分離機でペレットタンパク質や細胞のゴミを処理します。

上清液をイソプロパノール入りのチューブに移し、DNAを可視に見える鎖状に沈殿させるために混合します。遠心分離機でDNAをペレット化する。

不純物を除去するためにエタノールでペレットを洗い、自然乾燥させてDNAを再水和させます。

高温で培養してDNAを溶解させ、その後サンプルをマイクロキュベットに注入します。

分光光度計を使い、分離されたDNA濃度を測定します。

まず、きれいなハサミで柑橘類の木から丸ごと新鮮な葉を切り取り、きれいなビニールのサンドイッチ袋に入れます。次に、少量の液体窒素を加えて乳鉢と乳棒を冷やします。次に、はさみで葉組織の小さな片を約1平方インチほど切ります。

葉片をモルタルに入れてすぐに凍らせます。乳鉢で葉の組織を素早く粉砕し、液体窒素が蒸発し、細かい緑色の粉末が残るまで続けます。次に、金属製ヘラを液体窒素で10〜15秒間冷やします。次に、冷たいヘラで1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブでモルタルからすくい上げます。

1000マイクロリットルのピペットを使って、600マイクロリットルの核溶解液をサンプルに加えます。その後、サンプルを1〜3秒間ボルテックスさせます。チューブを65度の水浴で15分間孵化させます。

培養期間終了後、10マイクロリットルのピペットで3マイクロリットルのRNase溶液を溶解液に加え、RNAを除去します。次に、チューブの中身を2〜5回逆さに混ぜます。

キャビネットインキュベーターで37度の環境で15分間培養します。15分後に、サンプルに200マイクロリットルのタンパク質沈殿液を加えます。高速で20秒間チューブを渦巻かせろ。次に、サンプルを13000gで3分間遠心分離します。

遠心分離の過程で、室温で維持した600マイクロリットルのイソプロパノールを新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに加えます。遠心分離が終わった後、慎重に上澄液を遠心分離機チューブからイソプロパノール入りチューブへ取り出します。ペレットは捨てる。

チューブを逆さにしてDNAが見えるようにし、糸のような糸のようにしてください。次に、13000gで室温で1分間遠心分離します。

遠心分離後に上清液をデカントします。次に、70%エタノールを600マイクロリットルペレットに加えます。チューブを何度か逆さにしてペレットを洗います。

チューブを13000gで1分間遠心分離します。遠心分離が終わったら、上清液を慎重に吸引します。次に、蓋を開けた状態でチューブを逆さにして吸収紙の上で15分間自然乾燥させます。

乾燥したら、ペレットに100マイクロリットルのDNA再水和溶液を加えます。DNA懸濁液を65度の水浴で1時間孵化します。混ぜながらチューブを定期的に叩いてください。

マイクロキュベットに1マイクロリットルの精製水を加えます。分光光度計で水が空白と表示されます。次に、サンプルを1マイクロリットルのマイクロキュベットに加えます。マイクロキュベットを分光光度計に置き、DNA濃度を取得します。