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環境汚染物質を分解する細菌を含む多様な微生物を含む海水サンプルを取ろう。
サンプルを連続的に希釈して微生物密度を下げ、栄養培地にプレートします。
孵化後は形態的に異なるコロニーを選択し、遺伝的・代謝的に多様な細菌タイプを保持している可能性があります。
各選定コロニーをストリークして個々の細胞を分散させ、孵化させます。
各細胞はコロニーを形成し、遺伝的に純粋な細菌分離株として独自の代謝プロファイルを持ちます。
各分離株を培養培地に接種し、培養してバイオマスを増やします。
培養液を遠心分離し、上清液を捨て、バッファーで洗浄して残留培地を除去します。
細胞をバッファーに再懸浮させ、環境汚染物質であるEE2を含む選択培地に接種します。
培地中の唯一の炭素源として、EE2はエネルギーや成長のために代謝できる細菌を選択します。
培地中の濁度は細菌の増殖を示し、汚染物質分解性細菌分離株の分離が確認されます。
細菌を選択するには、まずサンゴサンプルに対して無菌生理食塩水で最大10からマイナス9までの連続希釈を行い、水サンプルでは最大10からマイナス6まで希釈します。ピペットで5回希釈してから先端を捨てます。
そして、それぞれを渦巻きます。次の連続希釈を行う前に、毎回5秒間サンプルを渦巻かせます。3%塩化ナトリウム溶原性ブロス寒天培地を含むペトリ皿に各希釈液を100マイクロリットピペットで抽出し、プレートにします。
例えば26度の目標温度で1〜3日間培養します。1日に1回はナンバープレートをチェックしてください。ストリークプレート技術を用いて、新しいプレート上で異なる成長形態を示すコロニーを選別・分離します。
この工程を必要なだけ繰り返し、純粋な菌群がプレート上で成長します。分離株は原稿に記載されている通り、4度の温度またはグリセロールで保存します。EE2分解能力試験を行うには、新鮮なプレートから単一のコロニーを選び、2ミリリットルの無菌LB培地をチューブ内に接種します。
もしグリセロールストックの場合は、グリセロールバクテリアストック10マイクロリットルを取り、LB寒天プレートにストリークしてください。24〜28度で一晩抱卵し、単一のコロニーが成長します。LB培地入りのチューブを、150倍g、24〜28度の温度で絶えず攪拌しながら一晩置きます。
細菌増殖後、細胞を8,000gの遠心分離で室温で8分間ペレット状にします。上清液は捨てる。残ったLBスープを洗うには、細胞を再び呼ぶために生理食塩水2ミリリットルを加えます。
洗濯を2回繰り返して、炭素源の痕跡が一切残っていないことを確認してください。洗浄・再懸濁された細胞は、EE2を唯一の炭素源とする最低限のブッシュネル・ハース培養培地に接種します。600ナノメートルの光学密度と、LB寒天培地上のコロニー形成単位による細菌増殖を16〜72時間の培養後に評価します。