Name: フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転位の定量法。インスリン刺激応答をマイオブラストで解析し、グルコース代謝や代謝疾患の研究に応用可能です。

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この作品は、ミセスクリフォードエルダーホワイトグラハムがCBに、NIH（AR052791、AR044387 - ARRA、＆NS063298）からLTTに研究基金とNIHの（AR059838）寄附からの補助金によって、医学サイトメトリーのベイラー大学によってサポートされていましたNIH（NCRR S10RR024574、NIAID AI036211、＆NCI P30CA125123）からの資金でコアをソートしてセル。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。

1。細胞の染色<ol><li>細胞を準備します。それでも積極的に（ - 80％コンフルエント60）成長中の細胞を使用する必要があります。回復するために2時間-血清は、一晩30分間インキュベーター内で24ウェルプレートと場所に0.5 mLの無血清培地（37℃、5％CO 2）にも当たり0.1万でプレートそれらの細胞を細胞を飢えさせるトリプシン処理から。 </li><li>一次および二次抗体を混ぜる。ミックス（AlexaFluor 488コンジュゲート1μL二次ニワトリ抗ヤギIgG抗体と一次抗GLUT4抗体の5μL）井戸のx数。暗闇の中で、室温で10分間インキュベートする。 </li><li>培地で希釈してインスリンの2X作業用ストックを準備します。 </li><li>細胞が付着したかしていないかどうかを確認します。 </li><li>穏やかに細胞を含むウェルにインスリンのご2X作業用ストックの6μL抗体ミックスと0.5 mLを加える。培地のいずれかの乱流を避けてください。暗所で30分間インキュベート（37℃、5％CO 2）、。 </li><li>細胞を振盪せずに、各ウェルにPBS + 1％PFAの0.5 mLを加えることによって細胞を固定する。暗闇の中で、室温で20分間インキュベートする。 </li><li>あなたの細胞がウェルに付着している場合は、軽く細胞リフターでそれらを持ち上げます。あなたのフローサイトメーターに適合して細胞をペレット化する遠心チューブに細胞を（1 mLの合計）に転送します。 </li><li> 0.4 mLのPBS + 1％PFAで1 mLのPBSに懸濁するで二回ペレットを洗浄します。この時点で、細胞はホイルでラップすることができますし、冷蔵庫に保存されている（4-8 ° C）または即時のデータ取得のためのフローサイトメーターに撮影。 </li></ol> 2。データ収集<ol><li>側方散乱光（SSC）に対する前方散乱光（FCS）パネルで、生細胞の周り広範なゲートを設定します。おFL1パラメータを設定するには、負のチューブを（アイソタイプコントロールとインスリンや細胞で処理していない細胞"ステンドグラス"）を使用してください。あなたのピークは、パネルで完全に下側のカットではないことを確認してください。 </li><li>チューブごとに少なくとも10,000個の細胞からデータを取得する。 </li></ol> 3。データ解析<ol><li> SSC VS FSCパネル（図1A）で生細胞の周りにゲートを描きます。 AlexaFluor 488蛍光強度に対する生細胞ゲート内の細胞（図1B）の数のヒストグラムをプロット。あなたは（図1C）の違いを視覚化する別のヒストグラムをオーバーレイが定量のために、各細胞集団の平均値と中央値蛍光強度を判断し、比較のためにこれらの番号を使用することができます。 </li><li>として図の1Cと1Dに示すようにインスリンの非存在下で得られた値にデータを正規化する。 </li></ol> 4。代表的な結果健常者（無インスリン抵抗性）から分離された筋芽細胞で、インスリンは細胞質から形質膜（図1、左）へのGLUT4の用量依存性の転座を誘発する。対照的に、インスリンは、インスリン抵抗性（図1、右）の患者から分離された筋芽細胞の形質膜へのGLUT4トランスロケーションを誘導しない。 <img src="/files/ftp_upload/2429/2429fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。染色実験の例。の筋芽細胞がインスリン抵抗性のないドナー（左）からとインスリン抵抗性（右）患者から分離された。生細胞の周りのゲートと、SSC（側方散乱光）に対するFCS（前方散乱）プロット。B、セルはゲート、GLUT4の外部エピトープに対する抗体で染色し、そして非刺激左（赤）またはインスリン1nMの（青）、10nMの（オレンジ）、または100 nm（緑）で刺激した。図をわかりやすくするために、我々は唯一、C。インスリン抵抗性を持つ細胞に100 nMのインスリンなしとでデータを表示Bに示すようにヒストグラムの蛍光強度（MFI）の平均（無インシュリン）非刺激のまま細胞のMFIに標準化した。 D、Bに示すように、ヒストグラムから正規化されたMFIのデータのプロット

<ol><li>Zhao, F. Q., Keating, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+and+genomics+of+glucose+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional properties and genomics of glucose transporters.</a> Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).</li>
<li>Karnieli, E., Armoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+insulin-responsive+glucose+transporter+GLUT4+gene%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology.</a> Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).</li>
<li>Graham, T. E., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+alterations+of+glucose+transport+and+molecular+mechanisms+of+intertissue+communication+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes.</a> Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+in+flow+cytometry%3A+the+future+just+started%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77, 705-713 (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、フローサイトメトリーにより細胞質から細胞の形質膜へのGLUT4のトランスロケーションを定量化するための迅速な技術を実証している。 GLUT4は、一時的に細胞の形質膜に発現され、エンドサイトーシスされる。結合した抗体は、さらにエンドサイトーシスの間に、GLUT4に接続されたままにするので、蛍光シグナルはインスリンの存在下でインキュベーションの選択した期間中に形質膜に露出されてGLUT4の総量を与えます。 この手法は、目的のタンパク質の外エピトープに向け良好な抗体を提供する、細胞内コンパートメントから形質膜への他の蛋白質の転座を勉強にも適用することができる利用可能です。例えば、同じようなアッセイは、現在一般的に4,5それらの形質膜にCD107aの転座を測定することにより、細胞傷害性Tリンパ球およびナチュラルキラーリンパ球の脱顆粒の割合を評価するために使用されます。細胞のアポトーシスやネクローシスの間に原形質膜の内側から外側へのホスファチジルセリンの転座はまた、蛍光標識アネキシンV 6を使用して、フローサイトメトリーにより検出することができます。 アッセイの迅速性に加え、フローサイトメトリーは、混合細胞集団における形質膜へのタンパク質転移の研究をできるという利点を提示。確かに、一つはマルチレーザーフローサイトメーター7のデータ取得、続いて細胞のサブセットマーカーのために、目的のタンパク質の染色を組み合わせることができます。 プロトコルのパラグラフ1.2で与えられた抗体の量は、出発点であり、私たちは、あなたがあなたの最大の信号を与える最小の抗体濃度を決定する目的の細胞を使用して抗体を滴定することをお勧めします。我々がここで使用している主要な抗ヒトGLUT4抗体が試験管当たり1〜10μL（チューブあたりすなわち0.2〜2μgの抗体）、これ以上の100万人以上のセルを含む各チューブになるための良い出発範囲。他の一次抗体の場合は、供給者の指示を参照してください。 細胞の自家蛍光は、ドナーからアクセプターへと実験間に変化するとして、データの正規化が必要である。

<table><tbody><tr><td>抗ヒトGLUT4抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1606</td><td>GLUT4の外部エピトープに対する抗体</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488結合ヤギ IgG抗チキン抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A-21467</td><td></td></tr><tr><td>リコンビナントヒトインスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>セルリフター</td><td>VWR international</td><td>29942-118</td><td>ウェルに合わせて切断して使用</td></tr><tr><td>FACS用5 mlチューブ</td><td>VWR international</td><td>60819-138</td><td>すべてのBD社製装置に対応</td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーによる細胞膜へのglut4転の定量的測定

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

グルコースはその血中濃度の一定の規制を必要とする、身体のエネルギーの主な情報源です。膵臓からのインスリン放出は、インスリン感受性組織、特に脳、骨格筋、および脂肪細胞によるグルコース取り込みを誘導する。 2型糖尿病および/または肥満に苦しむ患者はしばしばインスリン抵抗性を開発し、そのグルコースの恒常性を制御することはできません。インスリン抵抗性のメカニズムに新しい洞察は、2型糖尿病の新しい治療戦略を提供することがあります。 グルコーストランスポーターのGLUTファミリーは、本体1全体の異なる組織に分散し13人で構成されています。グルコーストランスポータータイプ4（GLUT4）はそのような骨格筋などのインスリン感受性組織による仲介グルコースの取り込みを主要なトランスポーターです。その受容体にインスリンが結合すると、GLUT4のグルコースの取り込みを誘導、細胞質から細胞膜へ転位する含有小胞。減少GLUT4転座は、2型糖尿病2,3のインスリン抵抗性の原因の一つです。 細胞質から形質膜へのGLUT4のトランスロケーションは、蛍光標識GLUT4 -特異的抗体を用いて、免疫細胞化学により可視化することができます。 ここで、我々は、フローサイトメトリーを用いて、選択した期間中に細胞の形質膜へのGLUT4転座の合計額を定量化する手法を説明します。このプロトコルは急速である（4時間未満、インスリンとのインキュベーションを含む）と一回の実験で、わずか3000のような細胞または条件ごとに、多くの100万などの細胞の分析を行うことができます。それはそれにバインドするとすぐそれが細胞膜へトランスロケーションした後に細胞外培地にさらされるとして、そのトランスポーターの外部エピトープに向けられた抗GLUT4抗体に依存しています。

このプロトコルは、フローサイトメトリーにより細胞質から細胞の形質膜へのGLUT4のトランスロケーションを定量化するために迅速なテクニックを説明します。

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

グルコースは生体の主要なエネルギー源であり、その血中濃度を常に調節する必要があります。膵臓からのインスリン放出は、...を誘導します。

この手順の全体的な目的は、インスリン曝露に応答した哺乳類細胞の細胞膜へのGLUT4の転移を検出することです。細胞内にのみGLUT4タンパク質を持つ血清飢餓状態の筋芽細胞を、まず24ウェル培養プレートに播種します。次に、蛍光標識二次抗体でプレインキュベートしたGLUT4の外部エピトープに対する抗体を細胞に添加し、続いてインスリンを添加します。細胞表面のインスリン受容体が活性化されると、GLUT4が細胞膜表面へと転移します。その後、培地中の抗体がGLUT4を認識します。この時点で細胞を固定し、フローサイトメトリーによって蛍光染色の強度を測定することができます。この手法は、ggl 4転位およびグルコース代謝の研究に使用できるだけでなく、膜上のCD 1 0 7 Aの露出を介したNK細胞の脱顆粒などの他の系にも適用可能です。本手順では、活発に増殖しているか、あるいはコンフルエンシーが60～80%であり、かつ一晩血清飢餓状態にした細胞を使用することが重要です。トリプシンで細胞を回収した後、洗浄し、通常の増殖培地で200,000 cells/mLの密度で再懸濁させ、24ウェルプレートに1ウェルあたり500 µLで0.1 million cellsずつ播種します。その後、トリプシンから細胞を回復させるため、37 °Cで1時間インキュベートします。その間に、一次抗体anti glute fourとAlexa Fluor 4 8 8標識二次抗体chicken antigo IgGを5:1の比率で混合します。各ウェルに抗体混合液を10 µL使用することを考慮して、必要な最終容量を算出してください。抗体混合液を室温の暗所で10分間インキュベートします。インキュベートしている間に、インスリンを増殖培地で目的の濃度まで希釈し、2倍濃度のワーキングストックを調製します。細胞を1時間インキュベートした後、インキュベーターから取り出します。細胞が入った各ウェルに、抗体溶液を10 µLずつ静かに加えます。少なくとも1つのウェルは未染色で残しておくようにしてください。この陰性サンプルは、後でフローサイトメーターのセットアップに使用します。次に、GLUT4の細胞表面への転位を誘導するため、各ウェルに2倍濃度のインスリンストック液を500 µL加え、プレートを37 °Cの暗所で30分間インキュベートします。インキュベーターから細胞を取り出した後、各ウェルに1 mLの1% PFA含有PBSを加えて固定し、プレートを室温の暗所で20分間インキュベートします。セルリフターを用いて固定された細胞をウェルの底面から穏やかに剥離させ、各ウェルから個別のファコチューブに回収します。チューブを遠心分離して細胞をペレット化し、ボルテックスして1 mLのPBSで再懸濁して洗浄した後、再度遠心分離します。この洗浄工程を計2回繰り返し、洗浄の合間には上清を捨ててください。最後に、洗浄した細胞を400 µLの1% PFA含有PBSに再懸濁します。これで、フローサイトメーターを用いてGlut4の細胞表面発現を解析することが可能です。サンプルを持ってフローサイトメーターに到達したら、まず未染色コントロールのデータ取得を開始してください。前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）のパラメータを用いて、広範な生細胞ゲートを設定します。次に、ヒストグラムの範囲内にネガティブピークが表示されるように、FL1チャンネルの電圧設定を調整します。これらのパラメータを設定後、各実験サンプルを測定し、1チューブあたり少なくとも10,000個の生細胞イベントを記録します。このヒストグラムは、0、1、10、または100 nanomolarのインスリンに曝露した筋芽細胞における表面GLUT4染色のアップレギュレーションを示しています。対照的に、インスリン抵抗性個体由来の筋芽細胞では、100 nanomolarのインスリンに反応してGLUT4をアップレギュレートすることができません。刺激した細胞の平均蛍光強度を非刺激細胞の強度で正規化すれば、正常な筋芽細胞とインスリン抵抗性筋芽細胞のMFIを直接比較することが可能です。本手順を用いることで、細胞の表面または細胞内にある追加のマーカーを染色し、混合集団における異なる細胞サブセットを同定することが可能です。

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生物学

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