マイクロ流体システムにおける細菌増殖を単細胞分解能で追跡

まずは逆型蛍光顕微鏡のステージに搭載されたマイクロ流体装置から始めます。

この装置は水平送りチャネルを備えたポリマーチップで構成されています。各チャネルには狭い溝が一端で密閉され、細菌細胞を線状鎖に閉じ込めるよう設計されています。

溝内には非運動性の細菌細胞があり、蛍光タンパク質を発現し、その可視化を可能にします。

各給餌チャネルはシリンジポンプに接続されており、栄養豊富な培地を制御された流量で供給します。

流れを始めて培地が溝に拡散し、細菌の成長を支えます。

閉じ込められた細菌細胞は溝内で分裂し、子孫の連鎖を形成します。

トレンチ設計により、開口端の新しいセルが洗い流され、最も古いセルの長期追跡が可能になります。

トレンチの画像を時間とともに撮影し、個々の細菌細胞の成長と分裂を追跡します。

PDMSの両側のカバーガラスをステージインサートの底部にテープで貼り付けて、装填済みデバイスを慎重にステージインサートに取り付けます。段挿入装置アセンブリを逆さまにしてPDMSを上向きにし、ホコリのないワイプなどの柔らかい表面に置きます。

フェーズ1シリンジポンプの流量を毎分35マイクロリットルに調整してください。次に1レーンずつ作業し、インレットニードルを挿入し、排気ビーカーに繋ぐアウトレットニードルを挿入します。装置の漏れを目で点検した後、出口チューブの余剰細胞が濁った縞状の形で現れるかどうかを調べ、これらは徐々に廃棄物ビーカーに向かって移動します。

装置が約15分間稼働したら、フェーズ1シリンジポンプを1.5マイクロリットル毎分に設定し、流れを一時停止します。ポンプと装置全体を倒立蛍光顕微鏡に持ち込み、フェーズ1培地の流れを毎分1.5マイクロリットルで再開始します。装置付きのステージインサートを慎重に顕微鏡に取り付け、必要に応じてテープを使って入口と出口のチューブを通してください。

画像診断に適した装置の位置を特定し、希望通り画像撮影を開始します。セルは通常、定常状態の指数関数的位相成長を読み取るのに数時間かかり、画像取得の開始は必要に応じて遅延させて、平衡期間後にイメージングを開始することができることに注意してください。