細菌エフェクタータンパク質を発現する細胞への誘導性遺伝子発現系のトランスフェクション

抗アポトーシス細菌タンパク質であるCaeBを発現するヒト細胞をテストしてください。

対照としてCaeBを欠く細胞を用いてください。

調節因子プラスミドと応答プラスミドの両方を含むテトラサイクリン誘導性遺伝子発現系と複合体を組んだトランスフェクション試薬を導入します。

調節因子プラスミドは転写活性化因子とサイレンサーをコードし、応答プラスミドはTREによって制御されるプロアポトーシスタンパク質をコードします。

細胞をインキュベートしてプラスミドの取り込みと調節タンパク質の発現を促進します。

テトラサイクリンがなければアクチベーターは不活性のままで、サイレンサーはTRE駆動の転写を抑制します。

テトラサイクリン類似体を加えて培養します。

この類似体は活性化剤–TRE結合を可能にし、プロアポトーシスタンパク質の発現を開始します。

対照細胞では、これがアポトーシスシグナルを刺激し、アポトーシスマーカーを活性化します。

CaeB発現細胞では、CaeBはアポトーシスシグナルを阻害し、マーカーの活性化を減少させます。

CaeB発現細胞におけるマーカー活性化の低下は、CaeBがアポトーシスを阻害していることを示唆しています。

この手順は、GFPまたはGFP-CaeBを安定発現するHEK293細胞を12ウェルプレートにシードし、1ウェルあたり100,000個の密度で開始します。

次に、DNAとポリエチレンミントランスフェクション試薬を75マイクロリットルのOpti-MEM培地に別々に準備し、室温で5分間培養します。複合体形成には、両方の混合物を室温で15分間一緒に培養します。その後、ポリエチレンニミンDNA溶液を細胞に滴り上げて細胞に加え、5%二酸化炭素に37度で培養します。

トランスフェクションから5時間後、培養培地に1ミリリットルあたり1マイクログラムのドキシサイクリンを加えることでプロアポトーシスタンパク質の発現を誘導します。その後、細胞を37度の温度で5%の二酸化炭素で18時間培養します。