タイムラプス顕微鏡を用いた細菌の生物学的ノイズの連続モニタリング

まず、アガロースゲルパッドの下に細菌を埋め込み、細菌を固定し単層増殖をサポートする培養プレートから始めます。

細菌は一貫して緑色蛍光タンパク質を発現し、遺伝子発現のリアルタイムモニタリングが可能です。

パッドの周りに追加のアガロースゲルを注ぎ、サンプルを密封して室温で固化させます。

プレートをテープで密封し、ガス交換を可能にするために穴を開け、結露を防ぐために反向きにします。

ゲルを安定させ、細菌分裂を防ぐために低温で培養してください。

次に、対物レンズに浸漬油を塗布し、プレートを共焦点顕微鏡ステージに置きます。

タイムラプス撮影を開始しろ。

GFPが徐々に成熟すると蛍光を始めます。細胞分裂の過程で、これらの蛍光タンパク質は娘細胞間に分散され、蛍光強度が低下します。

これにより、ノコギリ型蛍光パターンが生まれ、同じ環境下で同一の遺伝的細胞間でこのパターンの違いが遺伝子発現の生物学的ノイズを示します。

サンプルを撮像するには、フラスコを水から取り出し、ゲル溶液を体温まで冷やします。サンプルプレートの周囲に3ミリメートルのゲルを注ぎます。アガロースが固まったら、プレートをテープで封印し、25ゲージの針でテープにいくつかの穴を開けます。

その後、盤を逆さまにして4度Cで少なくとも30分間置き、アガロースが完全に固まるのを待ちながら細胞分裂を防ぎます。24時間以内に蛍光共焦点顕微鏡を使い、最小倍率で試料を特定し、顕微鏡の自動フォーカスシステムを作動させます。適切な対物レンズにオイルを塗り、プラットフォームコントローラーでプレートを動かして慎重にオイルを広げます。

その後、再び自動フォーカスを作動させ、Zステップ断面のデフォルトの提案に従ってサンプルを撮影します。