Name: スライスの準備、器官組織培養と視交叉上核における時計遺伝子の活動のルシフェラーゼ記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 学ぶ マウス視交叉上核の脳スライス調製と器官組織培養、ルシフェラーゼ記録による時計遺伝子発現の連続モニタリング手法。高時間分解能で概日リズムを詳細解析できます。

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FONCICYT 000000000091984; Jeansson、セーデルストレームKönigska sjukhemmet、マーサLundqvistさんとシグルドOCHエルザの基礎この作品は、スウェーデンの医学研究評議会（K2009 - 75SX - 21028〜01 - 3、K2008 - 61X - 20700〜01 - 3）によって賄われていたGoljesミンヌ、および医学SLS - 95151のスウェーデンの社会。教授ジーンD.ブロック、UCLAは、感謝して原稿上で貴重なコメントで知られています。我々はビデオ顕微鏡を提供するための博士マイケルAndäng博士とヘレナJohard HCNチャネルブロッカーのため、教授とアブデルエルManiraに感謝する。 倫理的配慮： 動物のすべての実験はカロリンスカ研究所と&quot;ストックホルムのノーラDjurförsöksetiska Nämnd&quot;で定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。全ての動物実験は、動物へのあらゆる可能なストレスや不快感を最小限に抑える目的で行われます。

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利害の衝突は宣言されません。

ルシフェラーゼレポーターの技術を持つメリットとデメリット昼間の勉強するために多くの異なる時点（サンプリング周波数に応じて、通常2-4時間の低時間分解能を与える）で組織採取を必要とするin situハイブリダイゼーション及びウエスタンブロットで 、このようなRT - PCRなどのex vivoでの方法とは対照的に、遺伝子と蛋白質の表現の変化、ルシフェラーゼレポーター技術は、高解像度（1-10分）と同じ準備で何日も概日振動の研究をすることができます。したがって、使用する動物の数は最小限に抑えられ、リズムの位相と周期への影響の詳細な研究は、通常、低時間分解能と、従来のサンプリング技術を利用可能ではない、実現可能である。しかし、リズムの相対的な振幅の測定が可能であるが、それはレポーター技術は定量的でないため、転写された遺伝子または翻訳されたタンパク質の量を測定するために使用することができないことが強調されるべきである。 組織の記録は、器官SCNの文化は成人の脳の長期的な（週）薬理学的操作を可能に開始し、直ちに培養、直接生体内光誘起位相シフトなどで 、 生体のストレスでの分子の影響を研究するための大きな利点の後に分析することができます無傷の成熟したシナプスのネットワークとルシフェラーゼレポーターの技術を含む組織は、何週間も安定した記録が可能になります。したがって、組織が健全な文化を得るために新生児または出生後早期にする必要はありません、と急性スライス慢性の薬理学的治療とは対照的に行うことができます。エピジェネティックな変化が検討される場合はないゲノムへのDNAの取り込みにつながるか細胞培養におけるプラスミド - レポータートランスフェクション、とは対照的に、トランスジェニックルシフェラーゼ - 動物モデル（だけでなく、レンティ-ウイルスのトランスフェクション）が良好である。それはこの文脈でも発光イメージングは、レコーディングにも概日リズムを研究の主要な研究室によって利用される単一のSCNのニューロン（〜60から10ミクロン）や他の細胞型、許されるように、高感度CCDカメラ11で、今日可能であることが述べられるべきである。最後に、いくつかの概日研究者は、一般的に時計遺伝子/蛋白質の振動16-19を勉強するために、そのような緑色蛍光タンパク質として、他のレポーターを用いた分子の発現のモニタリングを使用してください。 スライス厚の側面必要に応じて、ここで推奨SCNのスライス（200〜300ミクロン）の厚さが減少または増加させることができた。組織の文化の中で数日後に膜に平坦化するが、しかし、、それは組織7の実行可能性を維持するために最初にカットスライスの500μmの厚さを超えることは推奨されません。が100μmよりも薄いスライスは取り扱いが困難機械的および実際的な理由からです。 SCNの組織が不均質であるため、SCN（例えば、&quot;シェル&quot;と&quot;コア&quot;、と背比べ腹側の領域）内の異なる領域が異なる位相で振動するので、スライスの厚さは、ルシフェラーゼの出力信号の位相に影響を及ぼす可能性がありますフェーズの後に20と差動再同期は、21をシフト。より多くの組織は、光子の大きい数を発するので、スライスの厚さも光子数のベースラインに影響を与えます。分子振動の振幅は、このように間接的に植の大きさによって影響を受ける可能性があります。これらの理由から、制御と処理培養物は、常に同じ大きさ、厚さであることと同じ位相で、同じ振幅で発振するために、SCNの同じ領域を含む必要があります。 two一方的な核は、その一方で、ビブラトームカットが順番に小脳と二つの半球の間に切断分離が垂直であることに依存している水平方向と（角度がない限り、お互いにと同様の振幅と位相で振動するテーブルの表面に）。 SCNの培養を行う研究者は、SCNの文化は互いに位相で発振しないことが発生する可能性があります。練習とスライシング技術の標準化、スライスは常にSCNの同じrostro -尾レベルでカットされている、すなわち、結果が改善されます。 重要なステップ<ol><li>酸素供給は重要です。 脳は酸素22の多くを必要とするため、スライシング手続きは迅速である必要がある（3.1から3.10に近い、より良い、それが組織を健康に保つためにある〜5-6分です）。 </li><li> SCNは、温度変化や培地交換に敏感です。 SCNは、温度に敏感であり、大きな温度変化は、位相ペースメーカーをシフトし、実験的なアーティファクト23を引き起こす可能性があります。培地やソリューションは、培養中の数日後に薬を適用するなどの継続的な実験、、培地またはsolutio中に交換または追加される場合nは、さらに前に36〜37 ° C（チャンバー内と同じ温度）に事前に温める必要があります。培地交換を伴う薬理学的実験では、それは常に事前にエアコンの細胞培養培地と連携することが重要です。さらに/新鮮な、無条件の培地でアウト洗浄は、潜在的に分子のSCNのリズム24だけでなく、他の細胞型の培養25を位相シフトすることができます。 </li><li>培地組成物。 正しいpH及び浸透圧の文化組織をすることが重要です。空気緩衝培地はpHが6.8から8.2の範囲で最適なバッファ容量を持ち、細胞の呼吸の結果として発生する可能性のあるpHの変化をバッファリングするためにも適切であるHEPESが大量に含まれています。 HEPESは、一方、として培地中に少量に含まれている炭酸水素ナトリウム、と比較して温度変化に対して敏感です。重炭酸ナトリウムは、CO 2雰囲気下でこのように適切な低いpH（5.1〜7.1）範囲26内のより大きな緩衝能力を持っています。しかし、空気緩衝培地（DMEM 2902）に重炭酸ナトリウムの量を増加が大幅に浸透圧を増加させると同時に培地、アミノ酸、ビタミンおよびイオンの不正確な組成のターン結果に含めます。希釈することなく追加することができます。 培地を調製するためのアドバイス： <ol><li>媒体とを混合する際、正確なと注意してください。 </li><li>だけ新鮮か新鮮解凍したストック溶液を使用してください。 </li><li>非常に高い浸透圧の場合には、希釈する価値はありません。以上の5から6パーセントに希釈した培地は、ほとんどの場合動作しません。それが低すぎる場合浸透圧を高めるために、D -グルコースを使用してください。 </li></ol></li><li>フェーズは準備時間に起因するシフト スライス標本の時間は非常に重要です。スライスの手順はZT 6月12日12の間に実行された場合、位相でゼロまたは最小限の効果が得られる。すべてのスライスの解離は、準備の間の位相変動に起因する誤差を最小化するために、日周または概日周期の同位相で実行する必要があります。 </li></ol>実行可​​能な変更<ol><li>スライスが開始する前に酸素（95％O 2、5％CO 2）で飽和バッファー、急性SCNの電気生理学の場合、スライスはリンガー（ACSF人工脳脊髄液）で実行する必要があります。さらに、酸素は、電気とシナプス活動は、酸素の電源22に直接依存しているとして、全体のスライス手順の実行中にバッファに連続して追加する必要があります。 </li><li>水平方向と矢状スライスは正常に準備し、SCNを培養することができる。著者は、我々の経験によるとコロナのカットと比較して低い振幅で概日振動を与える水平スライスにおけるルシフェラーゼの録音と経験を、持っている。 </li><li> SCNはrostro - 尾側に長さ約1mmであるとスライシング技術は、ここで説明する中央部にSCNのセクションを取得を対象としています。ただし、複数のSCNのセクションは、SCNの核のより吻側対尾側レベルでの概日遺伝子/タンパク質発現の調査を可能にする、マウスおよびラットの脳から得ることができる。 </li><li>さらに、若い動物、出生後の仔や胚からスライスの培養物は、また、調製することができる。非常に若い子犬の脳と頭蓋骨は非常に柔らかく、敏感であることに注意してください。さらに、視神経は薄いと十分に発達していないです。 SCNの領域が損傷していないように仔の脳を解剖する際はご注意ください。彼らは大きすぎるので、例えば、マイクロ骨鉗子のツールは、仔マウスの頭蓋骨を開くために使用することができます。ファインはさみは若い仔で軟部組織を切断するのに十分です。 </li><li>ここで説明するカバーガラスベースの培養技術は、単一SCNのニューロンでは、CCD / EM - CCDカメラを用いた画像の発光にも使用できます。 </li><li>他の中枢神経系領域とトランスジェニックPER2から末梢器官組織：：LUCの動物が容易にPER2として、分子振動の面で、得られる培養し、分析することができます：：LUCの発現が他の組織の数にも多くの日のために発振し続けると細胞のタイプ10。これらの末梢組織のほとんどは、インスタンスの肝臓のために、生存のための膜を必要としないのではなく、直接媒体11を浴びて培養されています。により、切片にシフトその位相を注意してください、培養と培地交換はSCNと同じ原則に従っていない可能性があります。 </li></ol>意義トランスジェニックマウスとラット系統（：mPER2：LUC、mPer1 - lucを8、10、27）でルシフェラーゼ酵素活性は、タンパク質や遺伝子発現のリズムを反映し、生物発光の記録によって評価することができる。ルシフェラーゼによって生成される生物発光は、微弱な信号を与えるが、バックグラウンド発光は、この方法が有利なこと、ゼロに近いです。また、ルシフェラーゼ分子は不安定で速やかに分解されるためにはpHはありません長期的な興奮照明28の間に表示される可能性難聴、。一緒に、これらのプロパティは、概日研究において非常に有利なルシフェラーゼレポーターの技術を作る長期的な実験を可能にする。

<table><tbody><tr><td>B27サプリメント 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>Menzel-Glaser</td><td>40#1</td><td>&amp;#8776; 40 mm</td></tr><tr><td>培養メンブレン</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG50</td><td>0.4 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>DMEM 低グルコース フェノールレッド不含</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2902</td><td>1L分 粉末</td></tr><tr><td>ろ紙</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1003 055</td><td>&amp;#8776; 55 mm</td></tr><tr><td>ろ過セット</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>孔径 0.22 &amp;#x03BC;mポリエーテルスルホン</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>0203-7-PS</td><td>Dumant #7</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Invitrogen</td><td>14065-049</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>NaOCH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 7.5%</td><td>Invitrogen</td><td>25080-060</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>ルシフェリン</td><td>Promega Corp.</td><td>E1602</td><td>ホタルルシフェリン カリウム塩</td></tr><tr><td>マイクロロンジュール</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>332-097-140</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep 10,000 U/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>&amp;#8776; 35 mm</td></tr><tr><td>PMT</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>H9319-11MOD</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てメス</td><td>Paragon</td><td>P503</td><td>サイズ 11</td></tr><tr><td>真空フィルター</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-5</td><td></td></tr><tr><td>真空グリース</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>50 g</td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

スライスの準備、器官組織培養と視交叉上核における時計遺伝子の活動のルシフェラーゼ記録

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

生理学と行動で毎日のリズムを調整する中心的な概日リズム（〜24時間）クロックは、視床下部前部にある視交叉上核（SCN）に存在する。クロックは、直接網膜と視神経を介して光によって同期化されます。概日振動は、 周期 （ 単位 ）の遺伝子を含む、いわゆる&quot;時計遺伝子&quot;と、そのタンパク質産物の数、負のフィードバックループを相互作用によって生成されます。コアクロックはまた、膜の脱分極、カルシウムやキャンプ1に依存しています。 SCNは、時計遺伝子の発現、代謝活性と自発電気活動の毎日の振動を示しています。驚くべきことに、この内因性の周期的活動は、SCN 2-4の成体組織スライスに保持されます。この方法では、体内時計は簡単にペースメーカー機能の分子、電気生理学的及び代謝の研究を可能にする、in vitroで研究することができます。 SCNは、右の視交叉5の上方に位置する小規模な、よく定義された二国間の構造体です。ラットでは、それぞれの核に〜8.000ニューロンが含まれており、約947ミクロン（長さ、rostrocaudal軸）× 424μmの（幅）× 390μmの（高さ）6の寸法を有する。それは、SCNを識別することができる脳の特定のレベルでの脳のスライスをカットするために必要なSCNを分析する。ここで、我々は、マウスやラットの脳についても同様であるSCN、の解剖とスライスの手順を説明します。さらに、我々はどのように膜7、山崎らによってSCNの組織培養用に開発された技術上organotypically解剖組織培養に示す。8。最後に、我々は、動的なルシフェラーゼレポーターテクノロジー、もともとGeusz ら概測定に使用されたメソッドを使用して時計遺伝子/タンパク質の発現を測定するために使用する方法をトランスジェニック組織を示しています。9。 ：我々はトランスジェニックノックインPERIOD2からSCN組織をここでを使用してください：。ユジンらが生成されるルシフェラーゼマウス10。マウスは、PERIOD（PER）の融合タンパク質を含んで2とホタルの酵素ルシフェラーゼ。ルシフェラーゼは、ルシフェリンの酸化を触媒するときにルシフェラーゼの基質の存在下で翻訳されている場合PER2、すなわちルシフェリン、PER2の発現を生物発光として監視することができます。放出されるフォトンの数は、積極的に生産さPER2蛋白質の量に相関し、そして生物発光リズムは生体 10 で PER2蛋白質のリズムと一致している。この方法ではPER2の発現の周期的な変動が継続的に多くの日中にリアルタイムに監視することができます。我々は組織培養とリアルタイムの生物発光のレコーディングに従うプロトコルは、徹底的に山崎と高橋11で記載されている。

成体マウス視床下部視交叉上核（SCN）、そして文化への迅速な方法器官培養条件下でのSCNの組織を含む準備スライス、の手順が報告されています。さらに、動的なルシフェラーゼレポーターの技術を使用して振動時計遺伝子のタンパク質発現の測定が記述されています。

生理機能および行動における日リズムを調整する中心的な概日（約24時間）時計は、...に位置する視交叉上核（SCN）に存在します。

本手順の全体的な目的は、トランスジェニックマウスから視交叉上核をスライスおよび摘出し、その組織を培養することで、ルシフェラーゼ誘導発光による時計遺伝子またはタンパク質の発現を記録する方法を実演することです。まず、時計遺伝子またはタンパク質のルシフェラーゼレポーターを有するトランスジェニックマウスから脳を摘出し、次に視交叉上核を含む脳切片を作成します。手順の第2段階として、切片から左右の小さな視交叉上核を摘出します。手順の第3ステップは、培養液とルシフェリンを含むペトリ皿内のメンブレン上で、模式的な核外植えを培養することです。手順の最終ステップは、遮光された加熱チャンバー内で光電子増倍管を用いて生物発光を測定し、ルシフェラーゼ活性を記録することです。最終的に、時計遺伝子またはタンパク質の概日振動を示す結果を得ることができます。私の名前はSergey IVで、Gabrielle Re Clubで働いています。私の名前はSoFi Johanssonで、Gabriellaのチームで働いています。私の名前はGabriel Quistです。私は神経科学部門の主任研究員です。私の名前はKa LaShonで、スウェーデン医学神経科学センターの博士課程学生であり、Gabriellaと共同研究を行っています。ウェスタンブロット、RT-PCR、in situ ハイブリダイゼーションなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、同一組織内での時計遺伝子またはタンパク質の発現を、約1分という非常に高い分解能で数日間にわたって連続的に追跡できることであり、これにより概日リズムの周期、振幅、および位相の詳細な解析が可能になります。脳切片の作成と解剖の手順を習得することは困難であるため、この手法を視覚的に提示することは極めて重要です。SENは非常に小さいため、特定することが困難な場合があります。本手順のデモンストレーションは、私の研究チームのポストドクトラルフェローであるDr.Sge Veliaが行います。必要な溶液を作製した後、オートクレーブ用真空グリースが充填された5 mLシリンジを使用して、実験に使用するシャーレを準備してください。35 millimeter Petri dishの上部リング表面にグリースを塗布します。スライスごとに別のPetri dishを用意してください。Falcon tubeに10 millilitersの空気緩衝培地を満たします。これで8つの培養分に十分な量の培地が調製できます。新しく解凍したluciferianを10 µL加えます。luciferianは光に敏感であるため、Falconチューブを37 °Cの暗い加熱チャンバーに保管し、luciferian含有培地を遮光してください。次に、手順で使用するすべての器具、カバーガラス、およびその他の材料を滅菌します。滅菌されていないすべての器具に70% ethanolをスプレーしてください。器具とグリースを塗布したペトリ皿を、クリーンベンチ内で30分以上UV照射します。もう一つの準備ステップとして、ビブラトームをセットアップし、滅菌済みのカミソリ刃を取り付けます。これで手術 procedure のための装置の準備が整いました。マウスを麻酔し、断頭した後、鋏を用いて頭部から眼球を摘出します。これにより、視神経の訓練や刺激が防止され、視交叉上核（SCN）への損傷を避けることができます。精密剪刀を用いて、最終頸椎と皮膚を除去します。頭蓋骨の両側に沿って2箇所切開し、取り外し可能な蓋状の骨片を作成します。マイクロRon Jreツールを用いて頭蓋骨を開けます。RJを使用する際は、ツールで脳を押し付けないよう、常に上方向への動作で行ってください。視交叉上核（SCN）への損傷を防ぐため、嗅球が見えるまで完全に骨を除去します。微細マイクロ解剖用スプリング鋏を用いて、大脳半球と嗅球の間の視神経を慎重に切断します。マウスの頭部の下に、冷えたHBSSを50～100 mL満たしたペトリ皿を配置してください。頭部を反転させ、損傷のない脳を自然に脱落させます。視神経とは反対側で、必要に応じて他の脳神経を切断します。切り離されると脳がペトリ皿に落下し、これにより脳が急速に冷却されます。スプーンを用いて、氷のように冷えた脳を、逆さまにしたガラス製ペトリ皿の蓋などの滅菌済み切断面に移動させます。滅菌済みのカミソリ刃を用いて、大脳半球と小脳の間を垂直に切断し、小脳を除去します。バイオームの乾燥したプラットフォームに瞬間接着剤を塗布します。鋭い曲型ピンセットを脳の吻側部分に挿入し、ピンセットで脳を保持して持ち上げます。滅菌フィルターペーパーを用いて、HBSSを慎重に吸い取ります。吻側端を上にし、腹側表面をカッティングブレードに最も近い状態で、プラットフォーム上の接着剤に半球体を固定します。プラットフォームをビブラトームホルダーに取り付け、直ちに冷HBSSを満たします。垂直に正しく切断されていれば、半球はまっすぐに直立します。目的は、ビブラトームの最大速度を使用して、両側のSCNの中間領域を含む冠状切片を作製することです。交連に到達するまで、半球を500から800 µmの厚さで切除し始めてください。動画を確認してください。視交叉が広くなり、切片の厚さが100 µmに減少するのに伴い、coddle方向に切断を続けます。2つのSCN核が現れ始めるまで、ブレードの水平方向の手動移動速度を落としてください。SCNのレベルに達した際、核を視認するために必要に応じて拡大鏡を使用してください。250 µmのSCN切片を切り出します。ソフトブラシを使用して、中サイズのペトリ皿の蓋に冷えたHBSSを満たします。SCN脳切片を持ち上げ、ペトリ皿に移します。ペトリ皿を解剖顕微鏡の下に配置します。次のステップは、スライスからSCNを切り出すことです。顕微鏡を使用して、切片の少なくとも片側で両側のSCNが明確に確認できることを確かめます。滅菌済みのメス2本を用いて、両方のSCNを含む一辺約1.5 millimetersの正方形の組織を切り出します。SCNにできるだけ近い位置で切断します。SCN組織を除去することなく、視神経の小さな断片を説明片（explan）に付着させる必要がありますが、他の核を含めてはいけません。両側のSCNを含む組織を半分に切断し、2つの片側SCNを得ます。1つの片側SCNを、無菌フード内でコントロールとして使用できます。消灯状態で、直径35 mmのペトリ皿にLucifer培地1200 µLを加え、液体表面の上に培養膜を配置します。膜の下に気泡が入っていないことを確認してください。インプラントは非常に小さく、取り出すのが困難です。そのため、1000 µL ピペットとチップを使用して SEN 説明書をチップ内に吸い込み、培養メンブレン上に押し出してください。ルシフェラーゼ記録のために余分な HBSS を除去し、ペトリ皿1枚につき SEN を1つだけ配置してください。直径40 mmのカバーガラスでグリス塗布したペトリ皿を密閉します。密閉が不十分な場合は、グリスを追加してください。ペトリ皿を、36～37 °Cに設定された遮光加熱チャンバー内のaluma cycle装置に移します。培養を開始するために、lumサイクルチャンバー内に取り付けられている培養皿と光電子増倍管検出器アセンブリを確認します。培養皿を光電子増倍管の下、約1〜2 cmの位置に配置します。光電子増倍管は、ルミネッセンスによって誘導されるルシフェラーゼを検出し、増幅します。データ収集には Luma Cycle ソフトウェアツールを使用します。遺伝子タンパク質発現の高解像度データを取得するため、光子計数を1分から10分の間隔で積算します。その後、遺伝子タンパク質の概日発現を解析し、リズムの位相、周期、および振幅を決定します。この図は、健康なSCN組織培養と非健康なSCN組織培養からの生物発光記録を示しています。これらのマウスは、SCN組織を採取する前に12時間明期・12時間暗期の条件下で飼育されました。黒線は、period 2ルシフェラーゼ発現の生物発光記録における概日リズムを示しています。健康なSENスライスにおいて、タンパク質は概日変動に伴い振動し、タンパク質の最大発現はゼイバータイム（ZT）12～13、すなわち消灯時に起こります。したがって、遺伝子リズムの位相は、屠殺前に動物が飼育されていた明暗サイクルに依存します。青色の線は、4日目に培養皿を開封した後に適切に再密封されず、乾燥してしまったSEおよび培養物のバイオルミネッセンス記録を示しており、その時点を矢印で示しています。赤線は、不健康なSCN培養物からの生物発光記録を示しています。この図では、薬理学的実験におけるSCN培養物が用いられています。図には、最初の矢印で示された時点でHCNイオンチャネル遮断剤で処理された培養物のトレースが示されています。2〜3日間かけて、イオンチャネル遮断薬により概日振動が減衰し、2番目の矢印の時点で停止しました。この操作を行う間、薬剤を洗浄し、条件付けコントロール培地に置換しました。SEN組織の生存性を維持するため、迅速かつ慎重に作業することが重要です。また、常に同じレベルのSENが得られるよう、バイブラトームによる切断を標準化することが重要です。このビデオを視聴することで、メンブレン上のSEN培養物やSCN器官の切断および解剖方法、および培養物におけるルシフェラーゼ誘発発光による時計遺伝子またはタンパク質発現のモニタリング方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

これは、錐体ニューロンから電気記録を作成する目的のための器官培養における新皮質スライス標本を準備し、維持するためのプロトコルです。...

新皮質の器官型スライス標本からの全細胞記録

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Source: Sabado, V., et al., 名越、E. 単一セル解像度蛍光ライブイメージング ショウジョウバエ 幼虫の脳文化における概日時計。 J. Vis. Exp. (2018). このビデオは、...

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発光時計レポーターとシロイヌナズナプロトプラストトランスフェにおける概日表現型の迅速分析

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ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

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生体内で蛍光レポーターを使用してマウス視交叉上核における時計遺伝子発現のモニタリング

このプロトコルの目標は、前のヴィヴォ ショウジョウバエ幼虫の脳文化が長期的な蛍光タイムラプス...

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マウス神経新生時のノッチシグナル伝達ダイナミクスのリアルタイム生物発光イメージング

概日リズムは、ほとんどの生物に存在し、生物学的プロセスの時間的組織を調節しています。3Dオルガノイドは、最近、生理学的に重要な in vitro モデルとして浮上しています。このプロトコルでは、オルガノイドの概日リズムを観察するための生物発光レポーターの使用について説明し、多細胞系の概日リズムの in vitro...

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本レポートでは、オープンソースソフトウェアRStudioのRスクリプトを使用して、時系列実験から得られた大規模なデータセットを解析する方法について説明します。...

大規模データセットのユーザーフレンドリーで強力なR分析

学ぶ マウス視交叉上核の脳スライス調製と器官組織培養、ルシフェラーゼ記録による時計遺伝子発現の連続モニタリング手法。高時間分解能で概日リズムを詳細解析できます。

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