蝸牛内有毛細胞に接触求心性樹状突起でのシナプス後録音：リボンシナプスでのモニタリングの多胞体のリリース

この手順の全体的な目標は、内有毛細胞求心性シナプスでのシナプス後活動を記録することです。これは、最初に、首を切られたラットから最近摘出された蝸牛の感覚上皮を露出させることによって達成されます。手順の 2 番目のステップは、切除されたアピカルを配置し、修正されたカバー スリップをオンにして、記録チャンバーに移すことです。

手順の3番目のステップは、記録電極を備えた求心性バトンを見つけてアクセスすることです。手順の最後のステップは、求心性線維膜にタイトなシールを形成し、次に破裂させて、パッチクランプ技術の全細胞構成を確立することです。最終的には、単一のリボンシナプスから全細胞パッチクランプ電気生理学を通じて、シナプス後の発生または電位を示す結果を得ることができます。

蝸牛組織の解剖と調製は習得が難しく、小さな求心性線維の認識とアクセスが難しいため、この方法を視覚的に実証することが重要です。解剖を開始する前に、録音中に準備を所定の位置に保持する修正されたカバースリップを準備してください。8〜12ミリメートルの円形ガラスカバースリップを使用して、カバースリップの端に向かって半硬化シルガードを一滴垂らします。

細い虫ピンの太い端をカバースリップに置きます。昆虫ピンをガラスにしっかりと押し付けます。鉗子を使用して、加熱されたコイルに対してシルガードを加熱して設定します。

添付のテキストで説明されているように、10〜20個の微小電極を準備します。マイクロ鍛造で火研した後、マイクロ電極の外側の先端径は約1ミクロンである必要があります。ピペットの壁の最終的な厚さは、3週齢のラットの麻酔と斬首後のマイクロメートルの約3分の1に相当します。

皮膚を切除することから解剖を開始します バイ 頭を解剖し、脳を切除します 側頭骨を露出させるには、両方の側頭骨を取り除きます。各側頭骨を、標準的な細胞外溶液が入った清潔な解剖皿に入れます。次のステップは、側頭骨をカプセル化して骨を取り除き、蝸牛を露出させることです。

側頭骨を一対の鉗子で基部にしっかりと保持します。円形と楕円形の窓と蝸牛を特定します。蝸牛の楕円形の窓とらせん状の面が上を向くように蝸牛の向きを合わせます。

蝸牛の周りの余分な骨を取り除きます。2組目の細い鉗子を使用して、骨の他の部分よりも透明な領域から始めて、骨を蝸牛から直接削り取ります。ここでは骨が薄く、取り除きやすくなっています。

アピカルコイルの周りから骨を取り除き続けます。マイクロ解剖ハサミを使用して、頂端ターンの下のモディを切り抜きます。次に、蝸牛の下部のターンから頂端ターンを外します。

アピカルコイルの保護に注意してください。引っ張ったり伸ばしたりしないでください。最後に、組織をあまり引き裂かずに、蝸牛から頂端回転を取り除きます。

細い鉗子を使用して、骨の残りの部分を取り除きます。次のステップは、眼球のSTRと膜を切除することです。有毛細胞領域の外側にある光沢のある組織のストリップであるoculisのSTRを慎重に取り除きます。

STRとともに簡単に剥離する可能性のある感覚有毛細胞の除去は避けてください。次に、細い鉗子を使用して膜を剥がします。感覚有毛細胞の上にある光沢のある半透明の膜は、余分な組織と骨をトリミングし、鉗子で製剤を平らにします。

これは、組織をピンの下に均等に配置するために必要です。これで解剖は終了です。解剖が完了したら、ピンを有毛細胞から離して配置するように注意しながら、準備したカバースリップのピンの下に準備

鉗子を使用して調製物を記録チャンバーに移し、蝸牛組織を保持しているカバースリップに細胞外液を一滴残し、すぐに細胞外溶液の増殖を開始します。調製物の生存率を向上させるには、顕微鏡の10倍対物レンズまたは40倍水浸DIC対物レンズを使用します。調製物の位置を特定するには、記録電極が内有毛細胞の側壁に対して直角に近づくことができるように調製物を向けます。

製剤が丸まっているために内有毛細胞の基底部の視認性が制限されている場合は、記録電極を使用して、製剤の外縁をガラスカバースリップに押し付けます。内側の有毛細胞自体を圧迫しないように注意してください。この調製では、上部電極は、求心性バトンが配置されている下部電極マークの下に調製物の外縁を保持しています。

参考までに、NC 70 Nuv Conカメラは、モニターにForexの拡大画像を表示し、内有毛細胞領域の組織が健康であるかどうかを評価します。参照点として毛束を見つけ、焦点を合わせて核を見つけます。求心性末端を持つ内有毛細胞の基部に向かってさらに焦点を合わせ、モニター上の核のレベルに達するまでバックアップします。

次に、内有毛細胞の基部の周りに求心性バトンを配置します。バトンは球形または楕円形で、直径は約1ミクロンで、色は薄く、光沢のある外観です。あなたは上下に焦点を合わせることによってそれらを見つけるでしょう。

次のステップは、細胞内溶液で満たされた1ミクロンの先端を持つ記録電極を使用して、求心性線維への経路をクリアすることです。正圧を加え、マイクロマニピュレータを使用して電極を調製物に操作します。この電極を使用して、内側の有毛細胞基部のレベルで製剤を切開します。

支持細胞の薄い層と内有毛細胞の間に電極を陽圧で押し込み、内有毛細胞の基部へのアクセスルートを作ります。電極を慎重に取り外し、先端が細胞内溶液で満たされた直径1ミクロンの新しい電極と交換します。正圧を使用して電極先端を清潔に保ち、記録電極を隣接する支持細胞の周りのアクセス穴を通して求心性バトンに向けて動かします。

電極の先端が求心性バトンの真正面にあることを確認すると、支持細胞や内有毛細胞膜よりもピペットの動きに対する抵抗が大きくなります。この違いは、ピペットを動かしたり、ピペットを上下に動かしたり、ブートンが動くことを確認するために押したりすると感じられます。これは、ピペットチップとブートンが同じ焦点面にあり、電極が求心性ブートンに押し付けられていることを示しています。同時に正圧を解放し、吸引を加えてギガオームシールを形成します。

穏やかな吸引力を加えて電極内の膜を破裂させ、全細胞記録を取得します。パッチを当てた細胞が求心性バトンである場合、全細胞記録モードで小さな容量性過渡現象が観察されます。この図は、求心性ファイバーから記録された典型的な過渡現象を示しています。

シナプス活動の記録を開始します。求心性線維が自発的な活動を示さない場合は、カリウム濃度の高い細胞外溶液を適用して有毛細胞を脱分極させます。この図は、左側のAFFファイバーと右側の内有毛細胞の一般的な電流電圧関係を示しています。

電流電圧関係は、マイナス84ミリボルトの保持電位を記録し、マイナス124ミリボルトからプラス36ミリボルトまでの電圧ステップを10ミリボルト刻みで記録しました。電圧は、求心性ファイバーからの電流電圧関係に焦点を当てた一部のトレースの右側に示されています。興奮性シナプス後発生またはEPCは、電圧ステップの大部分に存在することに注意してください。

EPCは、約6ミリボルトの正で正を反転させました。この記録は、電位依存性ナトリウム電流をブロックするために毒素にテトラの存在下で行われました ブロッカーなしで 高速活性化ナトリウム内向き電流 記録にさらに現れ、記録を求心性繊維記録として識別しました。過分極電圧でゆっくりと内側に電流が作動することに注意してください。

この電流は、内有毛細胞や支持細胞には存在せず、記録が求心性線維からのものであることを示す良い指標となります。これらの記録は、内有毛細胞の電流電圧関係を示しています。矢印は、正の電位で急速に活性化する外側のカリウム電流を指しています。

これらに続いて、ピペットの直径が狭く、アクセス抵抗が高いため、整流器のカリウム電流が遅延します。ここに示されている内有毛細胞電流は、内有毛細胞電流の正確な記録を得るために予想よりも小さいです。アクセス抵抗の低いピペットを使用する必要があります。

しかし、ここで紹介する記録は、内有毛細胞と求心性線維の電流電圧関係を明確に区別できることを示しています。この図は、求心性線維から記録されたシナプス電流を示しています。EPC のサイズと形状が可変であることに注意してください。

録音は室温で行われ、電圧依存性ナトリウム電流を遮断するためにテトラトインが適用されました。この図は、内有毛細胞と接触する求心性バトンからの同時記録を示しています。電圧ステップを使用して内有毛細胞を脱分極し、それに応じて内有毛細胞から内向きのカルシウム電流が記録され、カルシウムの流入により神経伝達物質が放出され、求心性バトンでEPCが活性化されました。

この手順を試みている間、50ミリ秒の内有毛細胞の脱分極中に現れるシナプス陥凹に注意してください。蝸牛組織の解剖と準備に注意を払い、求心性末端から記録を試みるときは忍耐強く楽観的であり続けることが重要です。