細菌の癒着と内部化を評価するためのin vitro腸モデル

まず、上皮細胞とゴブレット状細胞の共培養を含むTranswellインサートから始めます。

上皮細胞は緊密な接合部を形成し、ゴブレット状細胞は粘液を産生し、生体内の腸上皮関門を再現します。

小腸消化を模倣するために模擬腸液で処理された口腔細菌群集の懸濁液を取る。

上部チャンバーの培地を細菌の懸濁液に置き換えてください。

振って培養し、細菌の付着と体内化を促進します。

非接着細菌を含む上部チャンバーから培地を採取し、その後の生存可能性アッセイに備えます。

粘液を溶かす溶液を加え、培養して粘液を溶かし、付着した細菌を放出します。

細菌の生存率と付着性のさらなる解析のために溶液を採取します。

細胞をバッファーで洗い、洗剤を加えて取り除きましょう。

セルサスペンションを集めろ。

細胞を溶かし、体内に宿った細菌を放出するために浮遊液を渦巻かせます。

遠心分離機で上澄液と細胞ごみを別々に採取し、さらなる分析を行います。

テキストプロトコルに従って洗浄・小腸消化の細胞密度を調整した後、トランスウェル系から頂端培地を取り出し、細菌懸濁液を1.5ミリリットル追加します。

一般的な細胞培養条件下で2時間共培養します。HBSSに10ミリモラーn-アセチルシステインを0.5ミリリットル加え、HT29-MTXによって生成される粘液を溶解し、付着した細菌を回収します。

プレートを37度の温度で攪拌下で1時間孵化します。NAC-HBSSをマイクロ遠心分離機チューブで回収し、1ミリリットルのDPBSを使って細胞を2回洗浄します。単分子層の上に0.5ミリリットルの0.5%トリトンX-100を加え、ピペットで細胞を破壊します。

その後、液体をボルテックスで1分間素早く回復させます。洗剤で細菌細胞を傷つけないために、速さが非常に重要です。テキストプロトコルに従ってサンプルを分析してください。