0 閲覧数 • 6:10 分 • October 30th, 2025
滅菌ヒト尿を含むマルチウェルプレートを取ります。
テストウェルに細菌を接種します。コントロールウェルには尿のみが含まれています。
カテーテル関連尿路感染症中にバイオフィルムが形成されるカテーテルの内面を模倣した 3D プリントされたシリコンコーティングされたデバイスを考えてみましょう。
それをウェルに入れ、プレートを密封し、インキュベートします。
細菌はデバイスの表面に付着し、尿からの栄養素を利用し、バイオフィルムを形成します。
デバイスを緩衝液ですすぎ、緩く結合した細菌を除去します。
クリスタルバイオレットを含むマルチウェルプレートにデバイスを置き、バイオフィルムと相互作用して染色します。
水ですすぎ、乾かします。
酸性溶液を含むマルチウェルプレートにデバイスを浸漬して、色素とバイオフィルムの相互作用を破壊し、色素を溶液中に放出します。
分光光度計を使用して、各ウェル内の溶液の吸光度を測定します。
対照ウェルと比較してテストウェルの吸光度が高いことは、デバイス上のバイオフィルム形成を確認し、カテーテル関連尿路感染症のモデル化に適していることを示しています。
まず、プールされたヒト尿サンプルを入手します。135マイクロリットルのプールされたヒト尿を、指定されたレイアウトに従って96ウェルプレートの各オンテストウェルに分注します。
各テストウェルに15マイクロリットルの正規化された一晩細菌培養を接種して、ウェルあたり150マイクロリットルの最終容量を達成します。その後の連続希釈検証ステップのために、この培養物を少なくとも100マイクロリットル予約します。
150マイクロリットルの滅菌プールされたヒト尿を指定されたウェルに加えることにより、ネガティブコントロールウェルを調製します。
次に、ペグを対応するウェルに挿入します。ペグの蓋がプレートと同じ高さになるまで押し下げ、マイクロプレートの蓋で固定し、必要に応じてテープで留めます。
次に、ペグモデルを、蒸発を防ぐために湿った青いロールが入った密閉されたプラスチック製の浴槽または袋に入れます。摂氏37度で24時間静的にインキュベートします。
接種物の検証のために、180マイクロリットルのPBSを96ウェルプレートの最初の列の2列から6行目に分注してから、予約した培養物を追加します。
次に、20マイクロリットルを最初のウェルから2番目のウェルに移し、上下にピペッティングして穏やかに混合します。最初の接種物が最終ウェルまで希釈されるまで、連続希釈を続けます。
次に、各希釈液から10マイクロリットルのスポットを適切な固体培地に3回ずつプレートします。摂氏37度で一晩インキュベートした後、各スポットからコロニーを数えます。
バイオフィルムの定量化のために、ペグモデルをマイクロプレートから取り外し、ペグを上に向けて、炎下または微生物学的安全キャビネット内で反転させます。使用済みのマイクロプレートは廃棄します。
ペグの蓋を180マイクロリットルの滅菌PBSアリコートを含む新しいマイクロプレートに移し、接着していない細胞を洗い流します。
次に、無菌状態で作業し、滅菌ガラス製試験管ラックをベンチに置き、ペグの蓋を保持する取り付けられたラックトップを取り付けます。
マイクロピペットを使用して、600マイクロリットルの滅菌PBSを各試験管に分注します。次に、ペグの蓋をラックに挿入し、ペグが試験管と位置が揃っていることを確認します。蓋からオートクレーブテープを剥がします。
滅菌鉗子を使用して、各ペグを蓋から真下の試験管に押し込みます。次に、試験管のキャップを交換し、各チューブを60秒間ボルテックスして、バイオフィルム関連細胞を取り除きます。
ボルテックスした各チューブから100マイクロリットルを取り出し、以前と同様に滅菌PBSで連続希釈を行います。
細胞をクリスタルバイオレットで染色するには、180マイクロリットルの0.1%重量/体積クリスタルバイオレットを滅菌蒸留水中で96ウェルプレートの24個のオンテストウェルにピペットで入れます。すすぎたペグモデルを対応するウェルに挿入し、室温で20分間インキュベートします。
染色後、ペグモデルをプレートから取り外し、使用済みのプレートを廃棄します。清潔な浴槽で、ペグモデル全体を流水水で穏やかにかき混ぜながらすすぎます。
さらに2回洗った後、ペグモデルを反転させ、室温で完全に乾燥させます。次に、180マイクロリットルの30%酢酸を新しい96ウェルプレートに加えます。乾燥したペグモデルを対応するウェルに挿入します。
インキュベーションが完了したら、ペグモデルをマイクロプレートから取り出します。マイクロプレートリーダーまたは分光光度計を使用して、540ナノメートルで染色されたウェルの光学密度を測定します。