C. elegansの正ブタノンの学習、短期、および長期連想記憶アッセイ

本実験の全般的な目的は、モデル生物としてC. elegansを用い、食物と化学誘引物質であるブタンとの間に学習された正の連想の短期記憶および長期記憶を検証することです。これはまず、同期させた十分に給餌された若成体虫を1時間絶食させることで達成されます。

次に、短期的連合記憶には大量条件付け（mass conditioning）、長期的連合記憶には間隔条件付け（spaced conditioning）を用いることで、餌と既知のブタンが存在する環境下で線虫を訓練します。条件付けの後、既知のブタンに対する走化性を測定し、未経験状態の走化性と比較します。記憶の保持を調べるため、学習指数（learning index）の変化に基づき、学習した餌と既知のブタンとの連合における短期および長期連合記憶の持続時間を示す結果を得ます。

この手法は、正常な老化および神経変性疾患の状態において、ニューロンの機能にどのような遺伝的経路が必要であるか、また学習と記憶をどのように改善できるかといった、認知老化および疾患分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。認知機能低下の状態において、1 mlのOP 50 E. coliを播種した100 mmの高成長培地プレートを用い、標準的な方法で線虫を調製します。1プレートあたり5,000匹以下の密度で、若成虫を使用してください。

M9バッファーをプレート上に静かに注ぎ、プレートを回して線虫を遊離させ、回収します。不要な細菌が脱落する可能性があるため、撹拌は最小限に留めてください。次に、プレートを傾け、隅からバッファーと線虫の混合液を吸い上げます。

P 1000ピペットを使用して、線虫を15 mLコニカルチューブに移します。プレートに線虫が残っている場合は、線虫を壁面に押し付けないように注意してピペッティングしてください。

このステップを1〜2回繰り返します。重力によって虫をチューブの底に沈殿させます。最良の結果を得るために、遠心分離は推奨されません。

細胞が沈降したら、バキュームで上清を除去し、M nine bufferを少なくとも3〜4 mL加えて洗浄します。飢餓状態を防ぐため、迅速に操作してください。この手順を2回繰り返し、計3回の洗浄を行います。

この時点で、後に実演する化学走性アッセイにおいて、訓練前の前処理を行うためのナイーブ群として使用する線虫のコホートを分けておきます。チューブに3〜4 mLのM9バッファーを加え、室温で1時間線虫を飢餓状態にします。500 µLのOP50 E. coliを播種した60 mm NGMプレートの蓋の内側に、10%ブタン（95%エタノール溶液）を2 µLストリーキングして、コンディショニングプレートを準備します。飢餓状態の線虫が入ったチューブからサピネートを取り出し、P1000ピペットを用いて、各コンディショニングプレートに100〜200 µLの線虫を移します。コンディショニング後、コンディショニングプレートを室温で1時間インキュベートします。

プレートから線虫を約1 mLのM9緩衝液で洗浄し、15 mLコニカルチューブに移します。緩衝液が透明になるまで、 previouslyに実演した穏やかな洗浄方法を繰り返します。洗浄後、一部の線虫を取り出して化学走性アッセイでテストし、1×mast連合学習のタイムポイント0のグループとして設定することで、他のタイムポイントを表すプレートを準備します。

100〜200 µLの線虫を、種付けした60 mmのNGMプレートに転移させます。これらの処理後プレートを、室温で0.5、1、または2時間インキュベートします。各タイムポイントの後、プレートから線虫を15 mLコニカルチューブへ穏やかに洗浄して回収し、この操作をさらに1〜2回繰り返します。

M9バッファーを用いて同様の緩やかな洗浄手順を行い、後ほど実演する化学走性アッセイを用いて短期連合記憶をテストします。短期トレーニングで実演した方法でコンディショニングプレートと虫を準備しますが、虫の室温でのインキュベーションは30分間のみとしてください。インキュベーション後、前述の方法で虫を回収します。

それらを種をまいていない60 mmのNGMプレートに移行させます。室温で30分間、種をまいていないプレート上で線虫を飢餓状態にします。飢餓状態にした後、線虫をM9バッファーで洗浄し、再び15 mLコニカルチューブに戻します。計7回のコンディショニングブロックと6回の飢餓ブロックが完了するまで、これらの手順を繰り返します。

コンディショニングが完了したら、コンディショニングプレートからワームを洗浄してコニカルチューブに戻します。既述の通り、コンディショニング直後に、一群のワームを用いて7回の間隔をあけた連合学習のテストを行うことができます。残りのワーム個体群を、1 mLのOP 50を塗布した100 mm HGMプレートに移します。

再び、個体数を維持するための細菌が十分に存在するよう、1プレートあたり100～200 µLの線虫を播種します。条件付け後のプレートを20 °Cで16、24、または40時間インキュベートし、餌とブタンの連合記憶に関する長期記憶のタイムポイントとします。線虫をプレートから15 mLコニカルチューブへ穏やかに洗浄して回収し、各タイムポイントの後にM9バッファーで1～2回洗浄した後、ケモタキシスアッセイで線虫をテストします。

化学走性アッセイプレートを準備するために、セットされていない100 millimeterのNGMプレートの底面に、ここに示すように側面の近く3か所に印を付けます。誘引物質およびコントロールのスポットに、1 molarのアジ化ナトリウムを1 microliterスポットします。麻痺剤の拡散を最小限に抑えるため、アッセイ開始の15分前までに行います。

次に、マーキングしたアッセイプレートの適切なスポットに、95% ethanolと10% butoneをそれぞれ1 µLずつ滴下します。これは、先に滴下したアジ化ナトリウムの上に重ねて行います。沈降した線虫が入ったチューブから、M9バッファーを可能な限り除去してください。

プリカットチップを装着したP 20ピペットを使用して、15 µLの線虫懸濁液を5 µLずつ3回に分けてアッセイプレートの起点に滴下します。次に、キムワイプの角をねじって小さく尖らせ、余分なM 9バッファーを吸い取ります。このとき、アガロースを突き破らないよう注意してください。

余分なバッファーを除去することで、線虫がアッセイプレート上に放出されます。イメージングを用いて線虫をカウントする場合、放出直後に起点位置を撮影することで、アッセイプレート上の個体総数を把握できます。化学走性アッセイプレートを室温で1時間インキュベートした後、エタノールおよびブトンのスポット（起点）に集まった線虫の数と、アッセイプレート上の線虫の総数をカウントします。

一般的に、アジ化ナトリウムで麻痺した虫体はスポットから半径1 cm以内に集まり、真っ直ぐな状態で静止します。多くの個体が重なり合っているため、手動でカウントするか、イメージングおよび解析ソフトウェアを用いて定量化します。簡便さと結果の信頼性の観点から、後者の方法を推奨します。

起点となるエタノールおよびブトンのスポットに集まった線虫の数を定量した後、ここで示すようにKeyAx指数を算出します。10%ブトンに反応する野生型線虫の典型的なナイーブな化学走性指数は、約0.2です。大量トレーニングまたは間隔トレーニングを行うことで、一般的に0時時点の化学走性指数が0.7から0.8まで上昇し、学習指数は約0.6になります。

未学習の化学走性は、線虫の適切な飼育管理に非常に敏感です。この図は、十分に給餌された未学習の線虫と飢餓状態の未学習の線虫との間にある化学走性指数（CI）の顕著な差を示しており、適切な手法の重要性を強調しています。記憶の保持は、野生型個体において学習指数がゼロになった際に、化学走性指数が未学習の状態に戻るまでにかかる時間に反映されます。

短期連合記憶は、約2時間の大量トレーニング後1時間で低下し始め、対照的に転写因子Crebには依存しません。長期連合記憶は、最大40時間の空間トレーニング後、通常16時間経つまで有意な低下は見られず、Creb依存的です。この手順を行う際は、走化性アッセイが飢餓状態や環境中の過剰な臭気によって影響を受ける可能性があること、また、過度な物理的刺激によって記憶や虫の状態が乱れる可能性があることに留意することが重要です。