複数のマウスの神経解剖学的磁気共鳴イメージング

この手順の全体的な目的は、複数のマウス脳MRIを用いて、生体または固定マウスによるハイスループットなフェノタイピングを実現することです。まず、各マウスに麻酔をかけます。次に、in vivoスキャンの場合、各マウスを適切なサイズのスレッドに配置し、ローディングアレイに取り付けてから、マグネットのボア内に設置します。

または、ex vivoイメージングを行う場合は、経心臓灌流を行い、頭蓋骨構造を分離してイメージングチューブに入れ、それをマグネットボア内に配置された16チャンネルソレノイドコイルアレイに入れます。最終的に、マウス脳の主要および微細構造において、表現型解析に適した高品質な脳画像を示す3次元磁気共鳴イメージングボリュームを得ることができます。組織学的検査などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、標本を頭蓋骨内に保持したまま肉眼的な解剖学的構造を維持でき、全脳のカバー範囲と3次元解析が可能であることです。

この手法は、疾患マウスモデルにおける表現型となる解剖学的差異と遺伝子との関係など、生物医学分野における重要な疑問の解決に役立ちます。一般的に、この技術に不慣れな方は、ハイスループットな脳イメージングに必要な、カスタムのマウスローディングおよび高周波コイルアレイの開発が必要であることに気づくでしょう。このプロトコルを開始する前に、個体識別や体重測定などのすべての動物取り扱い手順について、所属機関の地方動物ケア委員会、機関動物ケアおよび使用委員会、またはそれに準ずる組織から承認を得てください。

動物の記録は、生物学的安全キャビネット内で行ってください。次に、動物をオートクレーブ可能なプラスチック容器に移し、MRI誘導チャンバーまで運搬します。スキャン予定の動物を、4% ISOフルレインと毎分4リットルの酸素を用い、予熱済みの誘導チャンバー内で麻酔してください。

足裏をピンチ（つまむ）しても反応しなくなった時点で、動物は完全に麻酔されたと判断します。必要に応じて、カスタムスレッドに組み込まれたECGおよび温度モニタリングデバイスとの接触を良好にするため、ナレなどの除毛剤を用いて胸部の被毛を除去します。また、乾燥を防ぐためにTears Natural PMMなどの眼粘膜保護剤を眼に塗布し、約0.3 millilitersの生理食塩水を皮下注射します。

動物を水和させます。次に、ECG、呼吸、および温度プローブが組み込まれた個別のスレッドにマウスを載せます。前肢と後肢をスレッドにあるくぼみに慎重に配置してください。

ECGモニタリングが必要な場合は、マウス腹側の除毛部位がECGプローブと一致していることを確認し、ヘッドストラップとノーズストラップで各個体を固定した後、各スレッドをオープンエンドの50 milliliterコニカルチューブにスライドさせます。1回のイメージングセッションで、最大7匹の生体マウスをスキャン用に準備することが可能です。次に、コニカルチューブをローディングアレイに取り付けます。

すべての動物のセットが完了したら、すべての生理学的モニタリングラインを必ず接続してください。マグネットボア内のイソフルラン濃度を2%、酸素流量を8 L/minに設定します。次に、ローディングアレイをマグネットまで運び、レールシステム上に配置します。

レールシステムを使用して、ローディングアレイをマウスハイブに結合します。このシステムは、磁石ボアの中心に配置された各高周波（RF）コイル内にマウスを均一に配置するように設計されています。磁石に完全に挿入されると、ここに見られるように、遠心チューブがRFコイル内の麻酔送達システムにドッキングします。酸素と混合されたISOFフルオリンが、マウスハイブから各個別コイルの軸に沿ったチューブを通って検体へと供給されます。この麻酔ガス混合物は、マウスを通過してチューブ内を流れ、ローディングアレイの背面に取り付けられた能動的回収ユニットによって回収されます。

呼吸や体温などの動物の生理学的測定値に応じて、isoflorane濃度を0.9～2%に設定します。次に、高速バランスエコーシーケンスを用いて動物をスキャンします。3次元スキャン1回あたりの所要時間は約3時間で、得られる画像解像度は125 µmです。スキャン全過程を通じて、各動物のECG測定値、呼吸、および体温を必ずモニタリングしてください。

また、スキャンセッション中は、加温された空気の流れを用いて動物を保温してください。スキャンが完了したら、ローディングアレイをマグネットから取り出し、100%酸素で満たされた加温誘導チャンバーに入れます。チューブから動物を取り出し、プラスチック製の密閉容器に移して、生物学的安全キャビネットまで運搬します。

最後に、動物を暖かい無風のケージに入れ、exvivo動物イメージングに向けて麻酔から回復させます。まず、ケタミンとキシラジンの混合液を腹腔内投与し、動物を完全に麻酔します。灌流を開始する前に、足指または足先をピンチして、手術に適した麻酔深度にあるかを確認してください。

胸腔を開き、心臓の左心室に針または安全翼状静脈留置セットを挿入します。次に、心臓経由の灌流を開始するために右心耳を切断します。まず、1 µL/mLのヘパリンと2 mMのプロナゼを混合した、室温の1xリン酸緩衝生理食塩水30 mLを、約100 mL/hrの流速でフラッシュします。

この操作には約20分かかります。次に、室温の4%パラホルムアルデヒド30 mLに2 mMのプロナミドを混合した溶液を用い、100 mL/hの流速で次回の固定を行います。その後、動物を断頭し、皮膚、下顎、耳、および軟骨質の鼻先を除去します。

次に、残りの頭蓋骨構造を2mMのProHandsを混合した4%パラホルムアルデヒドに浸し、4°Cで一晩置きます。翌日、標本を保存のため、2mMのProHandsと0.02%アジ化ナトリウムを混合した1xリン酸緩衝生理食塩水溶液に移します。7Teslaでの高解像度3次元MRIスキャンは、少なくとも4日後、かつ2.5ヶ月以内に行う必要があります。

灌流後、撮像する脳を16チャンネルソレノイドコイルアレイに設置し、これをスキャナーに入れます。次に、ファストスピンエコー法を用いて検体をスキャンします。

このスキャン時間は約12時間であり、最終的な画像は32 micrometersの等方性分解能となります。スキャン完了後、イメージングコイルから検体を出し、各頭蓋骨を保存用の10%formalin溶液（2 millimolar pro hands含有）に浸します。ここに、1回の3時間スキャンから得られた複数のマウス脳画像を示します。

この図は、スキャンした7匹のマウスそれぞれについて3つの視点軸を示しています。ここでは、32 micronの等方性解像度での代表的なex vivo脳画像を表示しています。そして、ここではマスター処理後のex vivo画像ボリュームの3Dレンダリングを確認できます。

このin vivo手法は、適切に行えば3〜4時間で完了します。本手法は、多くの生物医学分野の研究者が、マウスモデルを用いてループス、ハンチントン病、アルツハイマー病などの疾患を探索するために利用できます。このビデオを視聴することで、MRIを用いて高品質な脳画像を得るために、生体および固定後の被験者の両方をどのように撮像するかについて、十分な理解を得ることができるはずです。

ご視聴ありがとうございました。