Name: 複数のマウスの神経解剖学的磁気共鳴イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T09:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学ぶ、複数のマウスを用いた高スループットMRIフェノタイピング法。生体・固定標本の両方で脳の三次元構造を可視化し、遺伝子変異と形態学的表現型の関連解析を支援する神経科学研究手法です。

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この作品は、小児病院、トロント大学のマウスイメージングセンター（MICE）の一部です。

1。 生体脳イメージングのマルチマウス： イメージング生きた動物、いくつかの重要な機能は、イメージングのセッション全体を通じて存在している必要があります：麻酔、2の1）安全な方法）、環境制御、3）生理学的モニタリング。また、同時に時のイメージング複数のサブジェクト、準備および画像の登録を容易にするために動物の位置の再現性の容易さと速度に関する複雑さをそこに追加されます。その結果、三大カスタムコンポーネントの設計および作製した：ローディングシステムをMRI内のRFコイルにマウスを挿入するために、組み込み監視に準備してプラットフォームを容易にするために誘導チャンバーは、位置を標準化につながります。 ローディングシステム： "マウスハイブ"と"ロード配列"：マウスの​​ローディングシステムは2つの主要部分で構成されています。マウスハイブの主な機能は、7つのヤスデのRFコイル（バリアンNMRシステム、パロアルト、カリフォルニア州）マグネット内部に六角形の配列に穴を配置するためです。ローディング配列は、麻酔ガスのエントリを可能にするために、そのヒントによってあけられた穴で50ミリリットルの遠心管に収容された複数のマウスを保持して輸送するように設計されています。マウスは磁石の付近に準備領域における麻酔と監視装置とのインタフェースになったら、それらは修正された遠心管に挿入し、負荷のアレイ上にマウントされています。レールシステム上のすべてのマウスをマウントした後、ロードする配列が転送され、磁石に挿入して配置されます。磁石のボアをプッシュダウンするときにレールシステムは、マウスのハイブを持つカップルに配列することができます。完全に磁石、RFコイル内麻酔デリバリーシステムに遠心チューブのドックに挿入する場合。酸素と混合イソフルランは、個々のコイルの軸に沿ってチューブを通してマウスのハイブの端から試料が供給される。この麻酔ガスの混合物は、マウスを過ぎて、チューブ内に流入し負荷の配列（図1）の背面に接続されたアクティブな清掃装置によって収集されます。 誘導商工会議所： イメージング時間は3時間程度かかることができるので、動物の準備時間を最小限に抑えることが、麻酔にマウスの露出を制限することが重要です。したがって、我々は、準備プロセス（図2）合理化するためのカスタム誘導チャンバーを開発しました。カスタム誘導室は複数のマウスの誘導および処理の両方を単一の環境を作成します。透明なアクリルから構築、誘導室の麻酔漏れを最小限に抑えるためにシリコンアイリスポートをselfclosing機能とは、ユーザーが特別な手袋を必要とせずに内部環境にアクセスすることができます。単一のマウスのための従来のマスクと回路に比べて、誘導室は二十マウスを収容するのに十分な大きさであり、扱いにくいチューブとマスクの付着することなくマウスの自由な操作が可能になります。ユニットはパッシブ掃気システムを使用して収集される麻酔ガスの一定流量で供給されます。抵抗加熱要素は、準備中に動物の体温を維持するために、チャンバーの床面を加熱するために使用されています。 そり： MRI用マウスを準備の中で最も扱いにくいと時間のかかる側面の一つは、心電図（ECG）電極および直腸温度プローブのアプリケーションです。さらに、このようなカフと針電極として、従来の電極を、、の多くは、それが困難なポジショニングを標準化すること、動物の姿勢を歪めることがわかった。したがって、我々は組み込みECG、呼吸と"そり"（米国特許7146936）（図3）と呼ばれる温度プローブを使用してカスタムフォームフィットポジショニングプラットフォームを考案した。ベルクロファスナーで作られた動きの制約は、頭部の動きを制限するために使用されていました。 in vivoでの脳のイメージングステップで複数のマウス： <ol><li>すべてのマウスの研究は、マウス操作の手順については、地元のACC（アニマルケア委員会）、IACUC（動物実験用の委員会）または同等の承認が必要です。 </li><li>そのような動物の識別、計量などのすべての手順は、生物学的安全キャビネット（BSC）の下とMRIユニットで実行する必要があります。動物は、オートクレーブ可能なプラスチックの容器に移し、MRI誘導室に運ばれます。 </li><li>マウスは、酸素の4％イソフルランと4リットル/ minを使用して、あらかじめ温めておいた誘導室で麻酔する。彼らは足のピンチへの応答に失敗した後の動物は完全に麻酔する。胸から毛皮は、ECGとカスタムそりに組み込まれている温度監視装置とのよりよいコンタクトを提供するために必要に応じてヘアリムーバー（Nairさん）を使用して削除されます。イブの軟膏（涙ナトゥPM）が乾燥しないように目に適用され、そして生理食塩水の約0.3 mLの水和を維持するために皮下に投与される。 </li><li> GD - DTPA - BMA（Omniscan）5月コントラスト強調を希望する場合は使用すること。のGd - DTPAを使用する場合、それは生理食塩水（最終容量300uL）中で希釈され、IPを経由して前のMRのセッションに1ミリモル/ kgの単回投与で投与。 </li><li>マウスは、ヘッドストラップとオープンエンド50mLのコニカルチューブ（図3）にスライドして固定化、個々のそりにロードされます。最大7生きたマウスを一度にスキャンすることができます。一度すべての動物は、接続されている生理学的モニタリングを搭載し8 L / minに2％および酸素のレベルにボア磁石のイソフルランレベルを設定されています。 </li><li>コニカルチューブは、磁石穴の中央に位置する各RFコイルに一様に位置マウスに設計されたドッキングシステム（図1）に搭載されている。一度ロードされると、イソフルランは0.9から2パーセントに減らすことができます。 ECGと温度は、スキャンの過程を通じてそれぞれの動物に監視されます。動物は、暖められた空気と、スキャンの過程で保温されています。 </li><li>それぞれの三次元スキャンの期間は約3時間です。詳細は次のとおりです：2300ミリと36ミリのTEeffのTRで高速スピンエコー。 （1）普通に8の列車の長さをエコー。結果として得られる画像の解像度は125ミクロン（図4）です。 </li><li>スキャンが完了すると、動物は、磁石から削除され、100％酸素で満たされた暖かい誘導チャンバ内でアンロードされます。動物は、プラスチック製の密閉容器に移し、BSCの下に輸送される。彼らは暖かいドラフトフリーケージの上に置き、麻酔から回復するために許可されています。 </li></ol> 2。複数のマウス生体外での脳のイメージング： モーションアーチファクトの影響を受けず、固定されたMR画像は、ライブイメージングよりも高い解像度を実現しています。高解像度、三次元データセットは、定量的な情報を抽出することで最大の柔軟性を提供し、自動画像解析が可能になります。カスタムRFコイルの配列は、一晩スキャンセッションの固定で、頭蓋骨のマウスの脳の16の高分解能MRデータセットの並列収集用に開発されました。 16コイルのex vivoでの脳イメージングアレイ： 特注の16コイルのソレノイドの配列は、同時に画像16サンプルを作成されました。この設計は60mmインサート勾配セットで同時に画像つのサンプルに使用される前の試作品を改良したものです。 8ターンのソレノイドコイルは、26ミリメートルの長さにわたって10％以内に均一な感度を提供するために両端の傷を超えていると個別にモジュール式のコンパートメント（IdziakとHaeberlen、1982）内にシールドされています。 16コイルのコンパートメントは、所定の位置で動きを最小限に抑えるために空気圧の膀胱を使用して、グラデーション内でのコイルとクランプを置いたフレーム（図5）、に組み立てられる。 複数のマウス生体外での脳機能イメージングのステップ： <ol><li>ケタミン（150 mg / kg）をとキシラジン（10 mg / kg）の腹腔内注射を介して麻酔マウス（の心臓の左心室に開いて胸腔と挿入針（または安全翼の輸液セット、25G × 3 / 4） 。右心耳をカット。 </li><li> 30mLの部屋温度1〜約100 mLの/ hrの流量でX PBS + 1μL/ mLのヘパリン（1000 USPの単位/ mL）+ 2mMのProHanceと同じ高経心臓的灌流。 </li><li> 100mLの/時間で30 mLの4％PFA（室温）+ 2mMのProHanceと固定パス。 </li><li>皮膚、下顎、耳、軟骨、鼻の先端を刎ねると削除。 </li><li> 4℃で一晩4％PFA + 2mMのProHanceの場所の残りの頭蓋骨の構造を℃に</li><li> 1X PBS + 0.02％アジ化ナトリウム+ 2mMのProHanceに転送する。 </li><li> 7テスラでの高分解能三次元MRIスキャンは、灌流後4日ではなく、より長い2.5ヶ月の間に発生します。脳は、16チャンネルのソレノイドコイルの配列（図5）に配置されます。 </li><li>イメージングのパラメータは次のとおりです：高速スピンTR 325 msのエコーと4の平均値との6の30ミリ秒、エコートレイン長のTEeff。最後の画像は32ミクロン（図6）の等方分解能を持っていると、スキャン時間は約12時間です。 </li><li>スキャンした後、10％ホルマリンで頭蓋骨を置き+保存のための2mMのProHanceを。 </li></ol> 3。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1マウスのローディングシステム。 "ローディング配列"と"マウスハイブは、"一般的なファイバーグラス製のレールシステムと接続。 <img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。誘導室。 <img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。）そり、埋め込 ​​まれた監視センサーとヘッドレストを示す。 B）ヘッドレスト付きそりで麻酔マウスが接続された。そりアセンブリは、簡単に遠心管にスライド。 <img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。 から in vivoの複数の脳の画像で &gt;代表。 <img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5 16の固定脳標本のスキャンのための16チャンネルのソレノイドコイルの配列。 <img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig6.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6。代表生体外脳画像。

<ol><li>Bock, N. A., Konyer, N. B., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-mouse+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Multiple-mouse MRI.</a> Magn. Reson. Med. 49, 158-167 (2003).</li>
<li>Dazai, J., Bock, N. A., Nieman, B. J., Davidson, L. M., Henkelman, R. M., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mouse+biological+loading+and+monitoring+system+for+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Multiple mouse biological loading and monitoring system for MRI.</a> Magn. Reson. Med. 52, 709-715 (2004).</li>
<li>Spring, S., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+revealed+in+the+structure+of+the+mouse+brain+using+three-dimensional+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism revealed in the structure of the mouse brain using three-dimensional magnetic resonance imaging.</a> NeuroImage. 35, 1424-1433 (2007).</li>
<li>Idziak, S., Haeberlen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+construction+of+a+high+homogeneity+rf+coil+for+solid-state+multiple-pulse+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Design and construction of a high homogeneity rf coil for solid-state multiple-pulse NMR.</a> J. Magn. Reson. 50, 281-288 (1982).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

生体と撮像時間を増やすことなく大幅にイメージング研究のスループットを向上させるために一度にex vivoでのマウスのイメージングシステムの画像を複数の被験者の両方。 生体および生体外で複数のマウスのイメージング技術の両方から脳の画像の品質は高くなりますし、それぞれマウスの脳でメジャーとマイナーの構造を表現型解析に適しています。 複数の検体の動物の準備時間を最小限に抑えるために、プロセスの並列化は最も重要である。例えば、誘導チャンバーの開発は、同時に複数の試料の誘導のために許され、身体の位置を標準化しながらそりは、ECGと温度プローブのアプリケーションを同期しました。さらに、私たちのex vivoでのイメージングシステムは、高スループットの表現型解析の研究に最適です一度に16の固定全体の脳の高解像度の3次元画像を取得することを可能にします。 in vivoイメージングシステムにおける当社の可能な限界は、個別に各マウスの麻酔薬と温度を制御することができないなどがあります。必要に応じて個々の麻酔薬のコントロールは、各マウスに対して排他的な麻酔気化器の追加により実装することができます。 in vivoイメージングシステムでのもう一つの制限は、スキャンが約32グラム未満であるマウスに限定されているということです。しかし、より大きな動物を収容するためにコイルのサイズを大きくするために、現在計画がある。

<table><tbody><tr><td>イソフルラン、USP (AErrane)</td><td>Baxter International Inc.</td><td>CA2L9108</td><td></td></tr><tr><td>NAIR</td><td>チャーチ &amp;amp; Dwight Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M.</td><td>Alcon</td><td>DIN 02082519</td><td></td></tr><tr><td>Omniscan（ガドジアミド注射液 USP） </td><td>GE Healthcare</td><td>J-110A</td><td></td></tr><tr><td>カスタムスレッド </td><td>Dazai Research Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カルシウム・マグネシウム不含PBS </td><td>Wisent Inc.</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン 10000USP/10ml </td><td>カナダ製薬パートナーズ</td><td>DIN 02264315</td><td></td></tr><tr><td>ProHance (ガドテリドール注射液 USP)</td><td>Bracco Diagnostics</td><td>11181</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド（粉末）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148-500g</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227-100</td><td></td></tr><tr><td>10%ホルマリン</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr></tbody></table>

複数のマウスの神経解剖学的磁気共鳴イメージング

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

磁気共鳴画像（MRI）によるマウスの表現型のフィールドは急速にヒト疾患のマウスモデルを特徴付けると評価するための改良されたツールの必要性によって動機づけ、成長している。 MRIは、遺伝子組み換え動物を調査するための優れたモダリティである。それは、脳全体をカバーすることが可能ですin vivoで使用することができる、とneuranatomyと生理学のさまざまな側面を調査するための複数のコントラストメカニズムを提供します。複数のマウスをスキャンする機能とともに、高磁場スキャナーの登場は同時に小説変異の迅速な表現型解析が可能になります。 効果的なマウスMRIの研究は、実験の設計の多くの側面に注意が必要です。この記事では、シールドの送信/受信電波の周波数で同時に画像をマウス（RF）の一般的な磁石のコイル（ボックら 、2003）そのシステムを使用してマウスの表現型解析のために品質の画像を取得する一般的な方法を説明します。我々は、特に解剖学的表現型、私たちのイメージングセンターで多くのマウスモデルでの影響の可能性が高い示されていることが重要とアクセス可能なアプリケーションに焦点を当てる。我々はそのような画像を取得するために詳細な手順を提供する前に、 生体の脳イメージング（太宰治ら 、2004）と注意すべきex vivoでの脳イメージング（春ら 、2007） の両方のための重要な実用的な考慮事項があります。これらについて以下に説明します。

磁気共鳴イメージング（MRI）は、遺伝子組み換えマウスの表現型を調べるために、ますますよく使われる道具となっている。この記事では、複数のマウスMRIを用いて遺伝子組み換えマウスのハイスループット表現型解析を実現するために必要なメソッドを示しています。

磁気共鳴画像法（MRI）を用いたマウスのフェノタイピング分野は、特性評価および...のためのより優れたツールへのニーズを原動力として、急速に発展しています。

この手順の全体的な目的は、複数のマウス脳MRIを用いて、生体または固定マウスによるハイスループットなフェノタイピングを実現することです。まず、各マウスに麻酔をかけます。次に、in vivoスキャンの場合、各マウスを適切なサイズのスレッドに配置し、ローディングアレイに取り付けてから、マグネットのボア内に設置します。または、ex vivoイメージングを行う場合は、経心臓灌流を行い、頭蓋骨構造を分離してイメージングチューブに入れ、それをマグネットボア内に配置された16チャンネルソレノイドコイルアレイに入れます。最終的に、マウス脳の主要および微細構造において、表現型解析に適した高品質な脳画像を示す3次元磁気共鳴イメージングボリュームを得ることができます。組織学的検査などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、標本を頭蓋骨内に保持したまま肉眼的な解剖学的構造を維持でき、全脳のカバー範囲と3次元解析が可能であることです。この手法は、疾患マウスモデルにおける表現型となる解剖学的差異と遺伝子との関係など、生物医学分野における重要な疑問の解決に役立ちます。一般的に、この技術に不慣れな方は、ハイスループットな脳イメージングに必要な、カスタムのマウスローディングおよび高周波コイルアレイの開発が必要であることに気づくでしょう。このプロトコルを開始する前に、個体識別や体重測定などのすべての動物取り扱い手順について、所属機関の地方動物ケア委員会、機関動物ケアおよび使用委員会、またはそれに準ずる組織から承認を得てください。動物の記録は、生物学的安全キャビネット内で行ってください。次に、動物をオートクレーブ可能なプラスチック容器に移し、MRI誘導チャンバーまで運搬します。スキャン予定の動物を、4% ISOフルレインと毎分4リットルの酸素を用い、予熱済みの誘導チャンバー内で麻酔してください。足裏をピンチ（つまむ）しても反応しなくなった時点で、動物は完全に麻酔されたと判断します。必要に応じて、カスタムスレッドに組み込まれたECGおよび温度モニタリングデバイスとの接触を良好にするため、ナレなどの除毛剤を用いて胸部の被毛を除去します。また、乾燥を防ぐためにTears Natural PMMなどの眼粘膜保護剤を眼に塗布し、約0.3 millilitersの生理食塩水を皮下注射します。動物を水和させます。次に、ECG、呼吸、および温度プローブが組み込まれた個別のスレッドにマウスを載せます。前肢と後肢をスレッドにあるくぼみに慎重に配置してください。ECGモニタリングが必要な場合は、マウス腹側の除毛部位がECGプローブと一致していることを確認し、ヘッドストラップとノーズストラップで各個体を固定した後、各スレッドをオープンエンドの50 milliliterコニカルチューブにスライドさせます。1回のイメージングセッションで、最大7匹の生体マウスをスキャン用に準備することが可能です。次に、コニカルチューブをローディングアレイに取り付けます。すべての動物のセットが完了したら、すべての生理学的モニタリングラインを必ず接続してください。マグネットボア内のイソフルラン濃度を2%、酸素流量を8 L/minに設定します。次に、ローディングアレイをマグネットまで運び、レールシステム上に配置します。レールシステムを使用して、ローディングアレイをマウスハイブに結合します。このシステムは、磁石ボアの中心に配置された各高周波（RF）コイル内にマウスを均一に配置するように設計されています。磁石に完全に挿入されると、ここに見られるように、遠心チューブがRFコイル内の麻酔送達システムにドッキングします。酸素と混合されたISOFフルオリンが、マウスハイブから各個別コイルの軸に沿ったチューブを通って検体へと供給されます。この麻酔ガス混合物は、マウスを通過してチューブ内を流れ、ローディングアレイの背面に取り付けられた能動的回収ユニットによって回収されます。呼吸や体温などの動物の生理学的測定値に応じて、isoflorane濃度を0.9～2%に設定します。次に、高速バランスエコーシーケンスを用いて動物をスキャンします。3次元スキャン1回あたりの所要時間は約3時間で、得られる画像解像度は125 µmです。スキャン全過程を通じて、各動物のECG測定値、呼吸、および体温を必ずモニタリングしてください。また、スキャンセッション中は、加温された空気の流れを用いて動物を保温してください。スキャンが完了したら、ローディングアレイをマグネットから取り出し、100%酸素で満たされた加温誘導チャンバーに入れます。チューブから動物を取り出し、プラスチック製の密閉容器に移して、生物学的安全キャビネットまで運搬します。最後に、動物を暖かい無風のケージに入れ、exvivo動物イメージングに向けて麻酔から回復させます。まず、ケタミンとキシラジンの混合液を腹腔内投与し、動物を完全に麻酔します。灌流を開始する前に、足指または足先をピンチして、手術に適した麻酔深度にあるかを確認してください。胸腔を開き、心臓の左心室に針または安全翼状静脈留置セットを挿入します。次に、心臓経由の灌流を開始するために右心耳を切断します。まず、1 µL/mLのヘパリンと2 mMのプロナゼを混合した、室温の1xリン酸緩衝生理食塩水30 mLを、約100 mL/hrの流速でフラッシュします。この操作には約20分かかります。次に、室温の4%パラホルムアルデヒド30 mLに2 mMのプロナミドを混合した溶液を用い、100 mL/hの流速で次回の固定を行います。その後、動物を断頭し、皮膚、下顎、耳、および軟骨質の鼻先を除去します。次に、残りの頭蓋骨構造を2mMのProHandsを混合した4%パラホルムアルデヒドに浸し、4°Cで一晩置きます。翌日、標本を保存のため、2mMのProHandsと0.02%アジ化ナトリウムを混合した1xリン酸緩衝生理食塩水溶液に移します。7Teslaでの高解像度3次元MRIスキャンは、少なくとも4日後、かつ2.5ヶ月以内に行う必要があります。灌流後、撮像する脳を16チャンネルソレノイドコイルアレイに設置し、これをスキャナーに入れます。次に、ファストスピンエコー法を用いて検体をスキャンします。このスキャン時間は約12時間であり、最終的な画像は32 micrometersの等方性分解能となります。スキャン完了後、イメージングコイルから検体を出し、各頭蓋骨を保存用の10%formalin溶液（2 millimolar pro hands含有）に浸します。ここに、1回の3時間スキャンから得られた複数のマウス脳画像を示します。この図は、スキャンした7匹のマウスそれぞれについて3つの視点軸を示しています。ここでは、32 micronの等方性解像度での代表的なex vivo脳画像を表示しています。そして、ここではマスター処理後のex vivo画像ボリュームの3Dレンダリングを確認できます。このin vivo手法は、適切に行えば3〜4時間で完了します。本手法は、多くの生物医学分野の研究者が、マウスモデルを用いてループス、ハンチントン病、アルツハイマー病などの疾患を探索するために利用できます。このビデオを視聴することで、MRIを用いて高品質な脳画像を得るために、生体および固定後の被験者の両方をどのように撮像するかについて、十分な理解を得ることができるはずです。ご視聴ありがとうございました。

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