機能と構造解析のためにペプチジル- tRNAを含む翻訳リボソームの分離

本実験の全体的な目的は、固有のペプチドtRNAを含む純粋なリボソームの構造と機能を解析することである。これは、放出因子を枯渇させた無細胞抽出液とビオチン標識mRNAを用いてインビトロ翻訳アッセイを行い、ビオチン標識mRNAに結合した停止状態のペプチドtRNAリボソーム複合体を生成させることで達成される。第2段階として、ストレプトアビジン結合常磁性ビーズをインビトロ翻訳アッセイ系に混合し、mRNA上のビオチン分子との相互作用を可能にする。

その後、磁場を用いてビーズを抽出することにより、mRNAに結合した停止状態のペプチドtRNAリボソーム複合体を全反応液から回収します。次に、精製したペプチドtRNAリボソーム複合体を、翻訳終結因子などの翻訳因子、翻訳阻害性抗生物質、または化学修飾剤と混合し、その機能を解析します。リボソームの阻害および構造に関する結果は、ペプチド転移酵素活性または翻訳終結アッセイ（SDSまたはTris-Racin pageゲルを使用）および修飾保護アッセイ（尿素pageゲルを使用）に基づき、ペプチドtRNAの加水分解の阻害と、それに伴うリボソームの構造変化との相関を示すことで得られます。

分画遠心法などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、単離されたサンプルに、単一の種のみのpep tRNAを含むリボソームが主に含まれていることです。この方法は、新生ポリペプチドの性質や、翻訳プロセスの調節など、抗生物質がリボソーム機能に及ぼす影響といった、遺伝子発現分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手順を開始するために、対数増殖期の培養液から得られた2 gの乾燥させたE. coli細菌ペレットを用意してください。

ペレットを1 Lのバッファーで再懸濁して洗浄し、続いて4 °Cで5,000 G、5分間遠心分離を行います。2回の洗浄後、得られた細菌ペレットを40 mLのバッファーで再懸濁し、フレンチプレスを用いて6,000 PSIの圧力をかけて細菌細胞を破砕します。この圧力は、1インチピストンを使用した際の600ユニットに相当します。

破砕した懸濁液を50 milliliterの清潔なガラスチューブに回収します。破砕懸濁液を1 millimolarのDIO triolまたはDTTで処理し、サンプルを30,000 Gsで30分間遠心分離します。得られた上清を除去し、遠心分離の手順を繰り返します。

2回目の遠心分離で得られた上清を回収し、最終的な上清をマイクロチューブに分注します。最後に、ドライアイス・エタノール混合液または液体窒素を用いて分注したサンプルを急凍結させ、-60°Cまたは-80°Cで保存します。

4.5 mLのProtein A Sepharose 4Bスラリービーズと5 mLの抗RF2抗血清を混合し、RF2を枯渇させたセルフリー抽出液の調製を開始します。混合液を回転台上において、室温で1時間回転させます。混合液を2,500 ×gで遠心分離し、ビーズを抗血清から分離します。

上澄み液を捨てます。これにより、ビーズにanti RF two抗体が結合した状態となり、以降これをanti RF twoビーズと呼びます。1 mLのbuffer beeで再懸濁し、ビーズを洗浄します。

その後、前述と同様にビーズを遠心分離し、anti RF two ビーズをバッファーBから分離します。この洗浄手順を2回繰り返します。ビーズの洗浄後、1 mLの細胞遊離抽出液を150 µLのanti RF two ビーズと混合し、回転盤を用いて4 °Cで2時間インキュベートします。混合物を10,000 Gで遠心分離し、細胞遊離抽出液をビーズから分離します。

上清を除去し、さらに150 µLのanti RF twoビーズで再度処理した後、インキュベーションとプルダウンをもう一度繰り返します。最終的なRF two除去済み細胞不含抽出液を、1本あたり100 µLずつマイクロチューブに分注します。分注したサンプルをドライアイス・エタノール混合液または液体窒素を用いて凍結し、-60°Cまたは-80°Cで保存します。

翻訳対象のオリゴデオキシヌクレオチド配列を含むプラスミドテンプレート、dNTPs、DNAポリメラーゼ、およびStrateg PCRバッファーを混合し、PCR反応液を調製します。PCRサンプルの調製後、増幅反応を行います。その後、3 M 酢酸ナトリウム（pH 5.2）を1/10量、および氷冷エタノールを2量分加えてDNAを沈殿させ、PCR産物を精製します。この沈殿操作をもう一度繰り返した後、得られたDNAを100 µLのジエチルジカルボネートまたはDEPC処理水に懸濁させます。

アガロースゲル電気泳動により、PCR産物の完全性を確認します。通常、この手順で600 bpのDNA産物が100 µg得られます。DEPC処理水を用いて、5 µgのPCR生成DNA断片をリボヌクレオチド、ビオチン標識UTP、およびT7酵素ミックスと混合し、100 µLのin vitro転写反応液を調製します。

反応混合物を37 °Cで3時間インキュベートします。得られたmRNA量を定量するため、RNaseフリーのDNaseを添加してDNAテンプレートを除去します。反応液を37 °Cで10分間インキュベートします。

mRNA産物を精製するため、1/10量の3 M 酢酸ナトリウム（pH 5.2）と2量の冷却エタノールを加えて、RNAを2回沈殿させます。沈殿したmRNAを100 µLのDEPC処理水に再懸濁します。アガロースゲル電気泳動により、ビオチン標識mRNA産物の完全性を確認します。通常、この手順により、600ヌクレオチドのビオチン標識mRNA産物が1〜2 mg得られます。ペプチジルtRNAを含む翻訳リボソームの単離を開始するため、DEPC処理水を用いて500 µLのin vitro翻訳反応混合液を調製します。

まず、付属の書面プロトコルに記載されている緩衝反応混合液を調製し、放射性アミノ酸に置換されるものを除く各アミノ酸を75 Mずつ添加します。次に、アミノ酸を含む緩衝液に、RF two欠損細胞抽出液を20〜50 µL添加します。リボソームを活性化させるため、混合液を室温で5分間インキュベートします。

リボソームを活性化した後、10〜15 µgのビオチン標識mRNAをサンプルに添加します。反応混合物を37 °Cで10分間インキュベートします。

その間に、バッファーCを用いてストレプトアビジン常磁性ビーズ（SMB）を3 mL準備します。インキュベーション後、SMP懸濁液を翻訳反応混合液に加えます。この新しい懸濁液を室温で10分間インキュベートします。磁気分離スタンドを用いて磁場をかけ、混合液からSMBを分離します。再懸濁します。

SMBをバッファーCに懸濁させ、マグネチックスタンドを用いてBeadsを再度分離します。この洗浄手順を2回繰り返した後、Beadsを500 µLのバッファーCに再懸濁させます。懸濁液を氷上に保存し、直ちに次の手順に進みます。ペプチドTRNAを可視化するには、懸濁させたSMBとバッファーCの混合液10 µLにローディングバッファー10 µLを混ぜ、10%Tris-Tricineポリアクリルアミドゲルにサンプルを泳動させて、Beadsに結合した成分を分離します。

真空ゲル乾燥機を用いてゲルを乾燥させます。その後、乾燥させたゲルをX線フィルムに感光させ、ペプチドTRNAの完全性と精製度を確認します。リボソームRNAを分析するには、dpci処理水で調製した2 mM EDTA溶液190 µL、水で等量化したフェノール200 µL、およびビーズ懸濁液10 µLを混合します。

得られた懸濁液を激しくボルテックスして混合します。室温で10,000 Gsで3分間遠心分離し、有機相から無機相を分離させ、上層の水層を新しいマイクロチューブに回収します。水層に、1/10容量の3 M 酢酸ナトリウム (pH 5.2)、1 µLの20 mg/mL グリコーゲン溶液、および2容量の氷冷エタノールを加えてRNAを沈殿させます。沈殿したRNAを10 µLのDEPC処理水に再懸濁します。

ニロスゲルによる電気泳動を行い、リボソームRNAの完全性を確認します。通常、50 µLのビーズ懸濁液から1 µgのリボソームRNAが得られます。ここでは、単離した翻訳リボソームの品質と機能性を評価した一連の分析結果を示します。

ポリアクリルアミドゲルで分離された特異的なバンドの観察は、SMBに結合したビオチン標識mRNAにポリペプチドが結合していることを示しています。リボソームRNAの精製により、これらのビオチン標識mRNAにリボソームも結合していることが確認されます。

リボソームのペプチジルトランスフェラーゼ活性を誘導する抗生物質であるピューロマイシンの添加により、新生ペプチジルtRNAの切断が起こります。これは、ポリアクリルアミドゲルにおける単離ペプチドの泳動パターンの変化として観察されます。以上のデータは、SMBに結合したビオチン標識mRNAが、ペプチジルtRNAを伴う機能的なリボソームを含んでいることを示しています。

特定のペプチジルtRNAを含む翻訳リボソームを単離することで、ペプチジルtRNA、抗生物質、およびその他の分子がリボソームの機能および構造に及ぼす影響を研究することが可能になります。ここで提示する例では、抗生物質のパルサミン（parsamyn）とアミノ酸のトリプトファンが、単離されたリボソームにおけるRF2による新生TNAC tRNAペプチジルtRNAの加水分解切断を阻害します。

トリプトファンまたはスパルセミシンとリボソームの相互作用は、翻訳リボソームの23S rRNAを構成する一部のヌクレオチドに構造変化を誘発します。この手法を習得すれば、手順に正しく従うことで、主要な工程を5時間で完了させることができます。cryo-EMなどの他の手法を用いてさらに構造解析を行うことで、特異的なペプチドRNAを含むリボソームの構造に関するさらなる疑問に答えることが可能です。