マウス胎児の腎臓の腎性帯からの細胞の単離と培養

この手順の全体的な目的は、発達中の腎臓から腎原性帯細胞の初代培養細胞を調製することです。まず、胎生17.5日の胚から腎臓を摘出します。次に、腎被膜を除去します。

次に、臓器に対して限定的な酵素消化を行い、腎原性領域からキャップ間充質および皮質ストロマ細胞を遊離させます。本手順の最終ステップは、細胞をフィブロネクチンでコーティングしたプレートに播種し、無血清培地で培養することです。最終的に、特異的マーカーの免疫染色により、精製された腎原性領域細胞集団であることが示された結果を得ることができます。

この手法は細胞シグナルの研究に使用できるだけでなく、細胞増殖に必要な基質の要件を理解するためにも応用可能です。例えば、生着技術について、本手順の実演を行うのは、私の研究室のテクニシャンであるDerek Adamsと、ポストドクのAaron Brownです。必要な溶液を調製し、記載されたプロトコルに従って組織培養皿を処理した後、E 17.5の母マウスを屠殺し、マウス胚腎臓の解剖を開始します。

施設内のガイドラインに従って子宮を摘出し、数ミリリットルのドコサート緩衝生理食塩水またはカルシウムおよびマグネシウムを含むDPBSが入ったペトリ皿に移します。解剖顕微鏡下で、時計職人用ピンセットを使用して胚を1つずつ取り出し、別のピンセットで断頭します。子宮からすべての胚を取り出し断頭させた後、胚が十分に浸る量のカルシウムおよびマグネシウムを含むDPBSが入った清潔なペトリ皿に胚を移します。

各胚について、血液および組織破片を可能な限り残し、ピンセットを用いて臍帯レベルの腹壁に円周状の切開を加えます。次に、胚を仰向けにし、1組のピンセットで肩を固定します。もう1組のピンセットを用いて、肺から膀胱までの内臓器官を取り除きます。

腎臓は内臓塊の背側に付着しています。次に、腎臓を他の臓器から慎重に剥離させます。この際、腎臓同士の接続を維持するように注意してください。

次に、一方のピンセットで腎臓間の組織を保持し、もう一方のピンセットでいずれかの腎臓の被膜に付着している副腎をつかみます。被膜を腎臓からゆっくりと剥がします。このとき、腎臓を傷つけないよう注意してください。

腎臓および、まだ付着している場合は子宮から、残っている被膜をすべて確実に除去してください。残りの腎臓についても同様に繰り返します。最後に、転送用ピペットを適切な直径にカットし、腎臓をHBSSが入った5 mLのポリスチレンチューブに慎重に移します。

各胚について腎臓の単離を繰り返し、滅菌環境下で1本につき最大8個まで腎臓をチューブに回収します。まず、ピペットを用いて腎臓が入った5 mLチューブからHBSS溶液を除去し、酵素消化プロセスを開始します。この際、腎臓に接触しないよう注意し、直ちに1.5 mLのコラゲナーゼ（パンクレアチン消化液）を加えます。

腎臓の各チューブについて同様に繰り返し、チューブにキャップをします。次に、37 °Cのインキュベーター内で、ミキサーを用いて15分間攪拌します。インキュベーションが終了する直前に、実施する各消化反応につき、1 U/µLのDNase 3 µLを新しい5 mLポリスチレンチューブに加えます。

インキュベーション後、速やかに消化物をインキュベーターから取り出し、75 µLのFBSを加えて3回反転混和します。その後、室温で2分間静置してください。次に、細胞懸濁液1.4 mLをDNAs Mixを含む5 mLポリスチレンチューブに移し、37 °Cのインキュベーター内でミキサーを用いて10分間攪拌します。

インキュベーション後、各細胞懸濁液を1.5 mLのエッペンチューブに移し、325 ×gで5分間遠心分離します。次に、上清を除去し、チューブを325 ×gで5分間遠心分離します。ペレットを1 mLの5% FBS含有HBSSで、ピペッティングを5～6回繰り返して再懸濁します。

次のサンプルに移る前に、各チューブにキャップをしてください。遠心分離後、SNATを除去し、すべてのチューブに培地を添加した後、各チューブに添加剤を含むKSFMを500 microliters加えてください。1 mil literマイクロピペットを用いて5〜6回ピペッティングし、各細胞ペレットを穏やかに再懸濁させます。すべての細胞懸濁液を、新しい5 milliliterポリスチレンチューブにまとめます。

次に、細胞懸濁液をあらかじめ濡らした40 micronのセルストレーナーキャップでろ過し、透過液を新しいポリスチレンチューブに回収します。透過液をすべて回収した後は、ピペットチップでストレーナーに触れないようにしてください。回収した透過液を、新しい濡らしたセルストレーナーで再度ろ過します。

ストレーナーを取り除き、新しいチューブの滅菌キャップでチューブを密閉します。細胞数を計測し、添加物を含むKSM培地を用いて、ファイバーコード培養プレートに1cm²あたり100,000から200,000個の密度で播種します。実験のための刺激を与える前に、加湿インキュベーター（37°C、5% carbon dioxide）内で2から4時間静置し、腎形成領域細胞を回復させ、接着させます。

ここでは、1平方センチメートルあたり200,000個の密度で播種し、24時間培養した腎形成領域細胞の位相差像（20倍）を示しています。この画像では、腎ネフロン前駆細胞に特異的なanti PAX2抗体で腎形成領域細胞を染色し（赤色）、核をDAPIで対比染色（青色）しています。

ネフロン前駆細胞のクラスターを40倍の倍率で位相差観察した像を示します。さらに特異性を実証するため、ストローマ細胞集団で発現するFox D1プロモーターの制御下でlaxyが発現している胚から、ネフロン形成帯細胞を単離しました。次に、発達中の腎臓のネフロン形成帯において、細胞核をDAPI（青）、F actinを phalloidin（緑）、および抗β-lactase（赤）で染色しました。

習熟すれば、腎原性帯細胞の単層一次培養を約2時間で作成することが可能です。これらの培養系は、ウイルス導入、組換えタンパク質による処理、および低分子化合物による処理に非常に適しており、ネフロン前駆細胞の発達における細胞シグナル伝達経路の迅速かつハイスループットな研究を促進します。さらに、細胞ソート手順を用いることで、これらの培養物から特定の細胞型を分離することも可能です。