修正されたES / OP9共培養のプロトコルは、造血後代の強化された特性を提供します。

本実験の全体的な目的は、マウス胚性幹細胞をさまざまな原始的および定常的な造血系譜へと分化させることです。すべてのES細胞由来細胞を特性解析するため、蛍光標識されたM strawberry OP9ストローマ細胞のコンフルエントな細胞層上にES細胞を播種することで、マウス造血細胞の分化を誘導します。分化または共培養の各日は、適切な回収時点における造血発達のさまざまな段階を表しています。

分化したES細胞の娘細胞は、セルソーティングによってM strawberry OP nine間質細胞株から分離することができます。このES分化プロトコルは、生体内で観察される原始造血および確定造血を再現しており、胚を使用せずにノックアウトES細胞株に関連する造血欠損を特性解析するために利用可能です。こんにちは。UCLAジョンソン総合がんセンターのJudith Gassen博士の研究室へようこそ。

私はアリシア・ポズです。今日ご紹介する手法の、既存のOP9共培養法に対する主な利点は、この手順により、5日目および8日目のすべての細胞を継代できるとともに、すべてのES由来の子孫細胞を完全に分離できることです。OP9ストローマ細胞は、2日ごとに交換が必要なOP9細胞培養培地で培養します。

OP9細胞は、共培養に使用する3日前に継代しておく必要があります。維持培養において、OP9細胞の密度が90%コンフルエントを超えないようにすることが重要です。まず、細胞をPBSで2回洗浄し、次に予熱した0.1% Trypsin-EDTAを加え、5分間置きます。細胞が剥離したら、OP9細胞培養液を加え、細胞を50 mLコニカルチューブに移します。

遠心分離後、室温で300 Gにて5分間細胞をペレット化し、上清を除去して、新鮮なM strawberry OP nine細胞培養培地で細胞を再懸濁します。共培養実験を開始する日に、最小密度10⁴ cells/cm²で細胞をプレートに播種します。3日前に継代したOP nine細胞は、コンフルエントである必要があります。ES細胞は、使用する細胞株の標準プロトコルに従って培養してください。

ES細胞をPBSで2回洗浄し、0.25% Trypsin-EDTAで処理して37°Cで5分間インキュベートします。次に、共培養分化培地をES細胞に添加し、15 mLコニカルチューブに移します。室温にて400 Gで5〜7分間遠心分離し、ES細胞をペレット化します。

上清を除去した後、ES細胞を共培養分化培地で再懸濁します。21ゲージの鈍端針を用いて、単一細胞懸濁液を作成してください。トリパンブルーと血球計数計を用いて細胞数を数えます。

次に、M strawberryのフラスコを取り出します。インキュベーターからOP nine細胞を取り出します。OP nine細胞から培地を除去し、フラスコプレートに共培養分化培地を加えます。

M strawberry OP nine細胞が含まれる各フラスコに、1 × 10³ cells/cm²のES細胞を播種します。細胞を37 °C、5% CO₂、加湿条件下でインキュベートします。これを0日目とし、共培養の状態はこのようになります。ES細胞とM strawberry OP nine細胞の共培養開始から3日後です。

境界が明確な、ES細胞由来の分化産物による大部分に大きな平坦なクラスターが観察され、一部の細胞は渦巻き状に形成され始めているはずです。共培養開始から5日後、共培養液を慎重に取り除き、新鮮な分化培地に交換します。コンフルエントなmSTRAW8 OP9細胞層上でES細胞が適切に分化すると、細胞が積み重なった渦巻き状に見える造血幹細胞（hemangioblasts）が形成されます。

この手順で最も重要な点は、共培養の5日目に適切な分化が起こっていることを確認することです。この時点では、ヒト胚芽盤胞コロニーを顕微鏡レベルだけでなく、肉眼でも観察できます。共培養物をPBSで2回注意深く洗浄し、0.25%トリプシンEDTAで細胞を剥離させます。ES分化培地でフラスコから細胞を回収し、チューブに移して室温で400 Gで7分間遠心分離し、細胞をペレット化します。

遠心分離後、上清を除去し、新しい培地を加えます。次に、21ゲージの鈍端針を用いて細胞を再懸濁させます。単一細胞懸濁液であることを確認するため、血球計数器を用いて細胞数をカウントします。ES細胞数は0日目から100〜150倍に増加しているはずです。8日目または9日目に、コンフルエントなM strawberry OP9細胞の新しい層の上に共培養細胞を再播種し、12日目に再度細胞数をカウントします。造血細胞を含む培地を除去し、回収して保存します。

モノレイヤーをPBSで1回洗浄します。浮遊している造血細胞を除去して回収し、フラスコに0.25% trypsin EDTAを加えます。トリプシンにより接着細胞を剥離させた後、ES分化培地で洗浄して回収し、先ほどの浮遊造血細胞と合わせます。室温で400 Gで7分間遠心分離します。最後に、21ゲージの鈍端針を用いて細胞を再懸濁し、細胞数をカウントします。これで、細胞を再播種または下流のアッセイに使用する準備が整いました。

ES細胞とM strawberry OP9共培養システムは、概説した造血発達のモデル化に使用できます。以下は共培養のタイムコースの概要であり、分化したES細胞由来の細胞を新しいM strawberry OP9細胞へ移行させる必要がある日を示しています。M strawberry OP9細胞のコンフルエント層上でES細胞を適切に分化させることで、Flk-1陽性細胞が産生されます。

共培養5日目の血管芽細胞。ヒト骨芽細胞は、血管内皮系および造血系の共通の中胚葉前駆細胞であり、この画像に示されているように、細胞が積み重なった渦状の形態として現れます。共培養が進むにつれて、6日目または7日目に2〜4個の細胞からなるクラスターが出現し、それがより大きな細胞クラスターへと成長します。造血前駆細胞は6日目までに存在し、最終分化した造血系細胞は14日目までに現れます。

対照的に、ESL分化が不適切に進行した共培養では、5日目にワールドパターンを示さないES由来の後代が生じます。ワールドパターンに細胞が存在しないことは、GIOブラストの形成が不適切であることを示しています。eblastの形成が不適切な共培養では、最終的に造血系分化が停滞するため、この修正ES OP nine共培養プロトコルにおいては廃棄する必要があります。

ES由来の子孫細胞はm strawberry陰性であり、M strawberry陽性細胞からフローソートで分離することが可能です。共培養の任意の日に9個の細胞を回収し、評価を行います。ここでは、代表的な実験の結果を示します。

以前に発表されたES OP nine共培養プロトコルでは、非接着性の浮遊細胞の継代および評価のみに焦点が当てられていました。本改訂プロトコルでは、接着細胞と非接着細胞の両方を含む、すべてのES由来細胞を継代し、評価することが可能です。これにより、造血細胞の収率が向上し、希少な細胞集団の同定が可能になるとともに、造血系および非造血系のすべてのES系譜細胞の完全な特性解析が行えます。