網膜色素上皮の全マウントするためのマウスの眼の解剖

私の名前はアリソン・クラボンです。テキサス州サンアントニオにあるUTヘルスサイエンスセンターのグリー小児がん研究センターで、アレックス・ビショップ博士の研究助手として勤務しています。本日は、網膜色素上皮の全量を回収するための齧歯類眼球の解剖方法について実演します。

この組織は、網膜の発達や疾患の研究において重要であり、生体内（in vivo）での相同組換え修復（HDR）アッセイの実施部位でもあります。それでは、始めていきましょう。こちらが解剖準備が整った眼球です。

まず、手技全体を通して指標として使用する解剖学的構造を確認しましょう。これは希釈された動物の眼です。こちらが眼の反対側にある視神経です。

これが角膜です。角膜を通して虹彩が見えています。眼球後方の白い部分は強膜です。

したがって、この領域は角膜強膜境界と呼ばれます。解剖の最初のステップは、筋肉結合組織や視神経などの不要な組織を除去することです。次に、円周状に切開して角膜を取り除きます。

この時点で、レンズを押し出すことで中空の眼球カップになります。次に、角膜強膜境界から視神経乳頭に向かって4箇所の切開を行います。これにより、4枚の花弁を持つ花のような構造になります。

次に、これら4枚の花弁のそれぞれを中央で切り分け、8枚の花弁を持つ花のような構造にします。この段階では、球状であるため、一部にたわみが生じることがあります。これを解消し、より平坦なホールマウントを実現するには、たわみが生じている箇所をわずかに超える程度の短い切り込みを8箇所入れることで対処できます。

ワークステーションに、100 µLまたは200 µLピペットと対応するチップ、X-P-B-S-A 35 mmディッシュ、スライドガラスおよびカバーガラス、スライド作成用の90% glycerolおよび透明のマニキュア、スライド乾燥用ラック、Kim wipes、および廃棄容器を用意してください。これらの一般的な材料に加えて、専用のマイクロダイセクションツールセットが必要です。ストレートピンセットおよび45度角度付きピンセットは、解剖中の眼球の保持、回転、および全般的な操作に使用します。また、15度角度付きのピンセットは、眼球の取り扱いおよび操作に使用します。

最後に、スプリングシザー（バネ付き鋏）を1本用意してください。一般的な鋏ではなく、必ずスプリングシザーを使用することが非常に重要です。また、解剖を開始する前に、背筋を伸ばして座った状態で、目が接眼レンズと同じ高さになるよう椅子の高さを調整してください。

顕微鏡での前傾姿勢は肩や背中の痛みの原因となり、解剖の質を低下させます。まず、35 mmディッシュの蓋にXPBSを1滴注ぎます。次に、解剖予定の眼球をディッシュに移します。

これは野生型C 57ブラックマウスの眼球です。直径約3.5 mmと非常に小さいことがわかります。強膜の不透明さにより、青みがかった色を呈しています。

解剖の最初のステップは、筋肉の結合組織や視神経など、眼の周囲にある不要な組織をすべて除去することです。ここでは、左手に45度ピンセットを、右手に15度ピンセットを持っています。一方のピンセットで眼を固定し、もう一方で組織を剥がして取り除きます。

大きな組織片が剥がれたときは、ピンセットをキムワイプで丁寧に拭き取ってください。その際、眼球を押しつぶしたり突き刺したりしないよう注意してください。懸濁状態でこの解剖を行う利点の一つは、眼球から離れて浮遊する結締組織を容易に確認できることです。

最終的に、ピンセットで組織をこれ以上除去できなくなる点に達します。15度の角度付きピンセットをスプリング剪刀に持ち替えてください。スプリング剪刀を使用して、視神経を切り離します。

ブレードの外縁を使用して、組織を角膜・強膜境界に向かって前方に押し出します。その後、トリミングを行い、キムワイプでハサミを轻轻に拭き取ります。もう一度確認しましょう。

組織が盛り上がっている場合は、ハサミの外側のエッジを使用して、組織を角膜強膜境界方向へ押し出します。トリミングを行い、ハサミの鈍い方のエッジで組織の断片を前方に押し出しながら、不要な組織がすべて除去されるまでトリミングを繰り返します。通常、眼球上には2本の強靭な組織帯が存在します。

1つ目は角膜強膜境界に固定されており、2つ目はトリミングされている様子が示されています。ここは角膜強膜境界と視神経乳頭のほぼ中間点にあたります。解剖の次のステップは、角膜と水晶体を除去することです。

45度ピンセットを使用して、角膜のほぼ中央でフラップをかき上げます。次に、スプリングシザーを用いてフラップの基部に小さな切開を加えます。シザーの下刃を切開部から虹彩の下に挿入します。

角膜強膜境界に向かって切開しますが、境界まで切り込まないようにしてください。次に、眼球を360度ゆっくりと回転させながら、周囲全体に小さな切開を加えます。ハサミを虹彩の下に維持し、角膜と虹彩を同時に切除するようにしてください。

ここで示すように簡単に操作できるようになるには、多くの練習が必要です。角膜を除去した後、眼球を横に向け、眼球の外側を軽く押して水晶体を押し出します。残りの構造は、次にカップ状になります。

眼球を4等分にする必要があります。そのために、眼球を横向きに置き、スプリングシザーの下側の刃を挿入します。視神経乳頭に向かって縦方向に切開しますが、乳頭まで完全に切らないようにしてください。

この操作を行う際は、両腕を体の横に下げ、ハサミを体および眼の切開線に対してほぼ垂直に、体の正面に保持します。1回目の切開の真向かいに2回目の切開を入れてください。滑らかな切開ができるよう、時間をかけて位置を合わせてください。

複数回切断すると切り口がギザギザになることがありますが、慎重に並べて切れば目立ちません。眼球が本来の形状を維持しているため、この球状の形態に抗うのではなく、それに沿って作業できている点に注目してください。PBSに浸した状態で保持し、以降の解剖はスライドグラス上で行います。45度角度付きピンセットで眼球をそっと支え、PBSから持ち上げてください。

眼球を新しいスライドガラス上に置きます。2組の角度付きピンセットを使用し、慎重に眼球を展開します。眼球の周囲に角膜と虹彩のわずかな縁があることに注意してください。ここは操作時に保持するのに便利です。

次に、4枚の花弁をそれぞれ半分に切断します。眼球を回転させ、花弁の1枚が身体に対して垂直になるようにします。15度の角度がついた鉗子で、花弁の角を把持します。

わずかに持ち上げ、角膜強膜境界から視神経乳頭に向かって切開します。これらの切開線は接線に対して垂直にする必要があります。接線とは、直径に対して垂直な線のことです。

したがって、切開は目の直径に合わせて行う必要があります。次に、次のペダルが身体に対して垂直になるようにスライドを回転させ、同様の手順を繰り返します。ペダルの角をつかみます。

わずかに持ち上げて切断します。4つの大きな花弁すべてを半分に切断するまでこれを繰り返します。白い物質は神経網膜であり、RPEの直上に位置しています。

神経網膜はRPE（網膜色素上皮）を保護できるため、すべての切開が完了するまでそのままにしておいてください。ペダルがわずかに湾曲していることに注意し、無理に矯正しようとしないでください。

正確に一度で切断できるよう、時間をかけて位置を合わせます。眼球は丸いため、折れ曲がりやすい傾向にあり、これを防ぐ必要があります。8か所にショートカット（切り込み）を入れることができます。

各花弁に1箇所ずつ行います。前の4箇所の切断と同じ基本戦略を用います。花弁の端を持ち上げて切断しますが、この場合は花弁の長さの約半分までだけ切断してください。

すべての切断が完了したら、神経網膜を取り除くことができます。ここでは、検体に1×PBSを数滴加えています。RPEを乾燥させないようにしてください。

神経網膜は、その下にあるRPEと緩く結合している必要があります。そのため、非常に簡単に剥離させることができます。ただし、通常は角膜強膜境界部では付着したままになります。眼球内部において、この部分は毛様体と呼ばれる凹凸のある隆起になっています。

15度鑷子の先端を視神経乳頭に挿入して標本を固定しながら、神経網膜を剥離させることができます。毛様体は、剥離した暗い色素沈着組織である網膜色素上皮（RPE）の端を示しています。ここは虹彩であり、RPEではありません。

虹彩は非常に粘着性が高く、神経網膜が剥がれやすくなっている場合や、その残骸が RPE に付着して残っている場合に、折りたたまれて RPE に張り付く可能性があるため、可能な限り多く除去することを推奨します。おそらく2つのうちのいずれかの原因で問題が生じたと考えられます。眼球の固定が不適切であった（固定時間が長すぎたか短すぎた）か、あるいは解剖前の保存期間が長すぎたかのどちらかです。

ここで取り出しているペダルには、まだショートカットが適用されていません。RPEの端から約3分の1の位置にペダルがあることがわかります。これが、8つのショートカットが推奨される理由です。

神経網膜をすべて除去した後、ピペットを用いてRPEを100から200 µLのPBSで数回洗浄し、すべてのゴミや破片を取り除きます。新しいスライドグラス上に、90% glycerolを80から90 µL、長方形になるように滴下します。なお、これは22×50 mmのカバーガラスに最適なグリセロール量であり、使用するサイズに応じて調整してください。

他のサイズのカバーガラスを使用する場合は、ピペットチップを用いてグリセロールを広げてください。グリセロールに気泡が入らないように注意してください。もし気泡が入った場合は、端まで移動させて消してください。

15度のピンセットの下アームをRPEの下に滑り込ませて慎重に持ち上げ、RPEをゆっくりとグリセロールの中へ下ろします。RPEはグリセロールの上に浮き、わずかに丸まったりねじれたりすることがあります。ピンセットを使用してRPEを伸ばし、RPEの表面にグリセロールをなじませてください。

気泡が生じた場合は、カバーガラスを約45度の角度に保持し、気泡を端まで移動させて消滅させてください。カバーガラスをグリセロールの端に接触させます。

次に、それをスライドの端へ移動させます。カバーガラスの下端を親指と人差し指で保持し、反対側の端を15度ピンセットで支えます。接触した直後、カバーガラスを非常にゆっくりとスライドに向けて下ろします。

RPEがある位置で降下を止め、グリセロールが広がるようにします。その後、カバーガラスをゆっくりとさらに下げてください。カバーガラスを下げる速度が速すぎると、スライド内に気泡が混入してしまいます。ここでは、カバーガラスをゆっくりとRPEに接触させ、グリセロールが広がるようにしながら下げていきます。

カバーガラスを素早く離すと、気泡が混入するのがわかります。透明なマニキュアをたっぷりと使い、カバーガラスの端をスライドガラスに固定します。外周全体を隙間なく接合してください。

これはC 57ブラックマウスの典型的な網膜色素上皮（RPE）です。ここに示されているように、下層の血管が見えるのは正常です。また、色素が薄いように見えるパッチ状の部分など、色素沈着に多少のばらつきが見られるのも正常です。

しかし、このような明確なスポットは、RPEおよびその下層にある脈絡膜への物理的な損傷に起因する可能性が高いと考えられます。目の脈絡膜もまた色素を有しているため、脈絡膜が健全なままであれば、黒色のRPEへの損傷が気づかれない可能性があります。

これは希釈マウスの典型的なRPEです。示されているように、血管が見え、色の濃い部分や薄い部分など、色素沈着に多少のばらつきがあります。しかし、希釈RPEで損傷を確認することはほぼ不可能です。

これらの小さな斑点は損傷なのか、それとも正常な色素沈着の変動なのか。この疑問を解決するために、固定と染色の実施を推奨します。これにより、サンプルの取り扱いが粗すぎないかを確認できるはずです。

この染色は細胞膜を明確に描き出すため、損傷部位が明白になりますが、実際にはRPE（網膜色素上皮）はかなり弾力性があり、角膜を持って眼球を扱う限り、損傷を与える可能性は低いです。ここに多くの問題があるホールマウント標本がありますが、その中でも最も軽微なのは、ここに示されている角膜の余白が広すぎることです。これにより、波打った組織がたわんだり折れたりすることがあります。また、眼球の背面に大量の外来組織が残っているのが確認できます。

このペダルは部分的に折りたたまれており、ここではRPEが部分的に裂けているのがわかります。もう一つの問題は、この眼がピンホイールのような外観を呈していることです。ここに切開の角度を書き込みました。

しかしながら、本来あるべき状態はこの通りです。切断は接線に対して垂直に、かつ直径に沿って行う必要があることを覚えておいてください。以上で、網膜色素のホールマウント標本を作成するためのマウス眼球の解剖方法についての実演を終わります。

上皮細胞の操作において、最も重要なことは正しい姿勢を維持することですが、同時にリラックスして行うようにしてください。このビデオがお役に立ち、今後の実験がすべてうまくいくことを願っております。