Name: 器官小脳文化：アポトーシス課題と検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 学ぶ 器官小脳培養法とアポトーシス誘導による細胞生存解析。野生型と変異マウスの小脳細胞に対するfast ligandの影響を免疫蛍光染色で評価し、神経科学における細胞死メカニズムの理解を深めます。

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本研究では、イプセン財団によって一部で賄われていた。 IMVは、分子生物学のアメリカの癌協会の教授であり、そして典型的なライフサイエンスのアーウィンとジョーンジェイコブスチェアを保持しています。この作品は、NIH、Leducq財団、Meriaux財団、エリソン医学財団、イプセン/ Biomeasure、サノフィアベンティス、前立腺がん財団、およびHNとフランシスC. Bergerの財団からの補助金によって部分的にサポートされていました。 PASは、神経科学のためのマックナイト基金基金と薬物乱用（R01 DA019022）の国民の協会によって資金を供給される。著者はマークシュミットに感謝します。グラフィックアートはジェイミーT.サイモンによって設計されました。スポンサーが親切にInvitrogen社によって提供された。

1。器官小脳文化： <ol><li>が正常に生成するために器官小脳培養は、P0〜P3やP8 - P12の間にマウスを使用してください。この発達段階は、我々の研究のためのより適切だったので私たちの実験のために我々は、P8 - P12の範囲でマウスを使用していました。 </li><li>解剖と培養液を準備します。 <ol><li>脳の解剖やスライス標本を1mMの塩化カルシウムを含む低ナトリウム人工脳脊髄液（ACSF）、10mMのD -グルコース、4mmの塩化カリウム、5mMの塩化マグネシウム、26ミリメートル、重炭酸ナトリウム、246mMスクロースおよびフェノールレッド溶液（1:1000）で実施されています、pHは7.3。ソリューションを殺菌するために、4で0.22μmのフィルターとストアを介してフィルタ℃に</li><li>小脳スライスを75％最小必須培地イーグル（MEM）、25％熱不活化ウマ血清、25mMのHEPES、1mMのグルタミン、5mgの/ mLのグルコース、ペニシリン（100 U / mL）およびストレプトマイシン（100 U / mL）に培養されています。二週間、最大で4で0.22μmフィルターとストア° Cを介してメディアをフィルタします。 </li></ol></li><li>それが赤からオレンジ色にシフトするので、以前にCarbogen（95％酸素、5％二酸化炭素）（注）でバブリング氷冷ACSF培地に脳を解剖し、Carbogenとその飽和は、溶液のpHを変更します。解剖は、脳の構造を損傷しないように注意しながら可能な限り最小限の時間で実行する必要があります。 </li><li>ビブラトームを用いて400μmの矢セクションで脳をスライスして。 <ol><li>小脳の可能な限り少ないカットしようとして、一方の半球にカミソリの刃と矢状切断してください、これはスライスのために平坦な表面を提供します。皮質は、スライスを簡単にするためにサポートのためにのみ使用されますが、時間が重要な問題であるため、それはかみそりの刃で皮質の吻側半分をカットする方が便利です。 </li><li>金属のビブラトームプレートに脳の位置を固定する（スーパーグルー）シアノアクリレートを使用します。接着剤を追加する前に氷の上でプレートを冷却する為、薄い接着剤層を形成するためにチューブの先端を使用しても、それを広めることが重要です。スーパー接着剤の過剰がある場合はそれはACSFに接触し、サンプルが失われるとき、それはプレートから分離させます。 </li><li>一度脳は、脳をカバーし、それが冷たい保つためにプレートの下に氷を置くのに十分なACSFのメディアを追加し、ビブラトームプレートに取り付けられています。 </li><li> 400μmのスライスをカットし、氷上でACSFを含む6ウェル細胞培養プレートにプラスチック製パスツールピペット（それを広げ、スライスへの損傷を避けるために、先端をカット）とそれらを転送する。 </li><li>解剖顕微鏡未満のインスリンの注射器（小口径28ゲージの針付き注射器）の助けを借りて脳の残りの部分から小脳を区切ります。いくつかのスライスは、スーパー接着剤が端に接続されている必要があります：これは、スライスの存続に影響を与えることができるとして、それを削除しようとする瞬間です。小脳の構造を損なうことなく、慎重にそれをすることが重要です。 </li></ol></li><li> 0.4μmの細孔と30ミリメートル培養プレートのインサートを含む6ウェルプレートに小脳スライスを転送する。 ℃、5％CO 2（細胞培養インキュベーター内）で37少なくとも2時間インキュベーションすることにより事前に調整されたウェル当たりの培地、1 mLを追加します。に気泡が下敷きにしないし、彼らが完全に引き出されているとは、液体がそれらをカバーしていないことを確認してインサートの上に小脳スライス（インサートあたり1-3）に配置されていることを確認してメディアの上に挿入して置きます。必要に応じて、メディアの過剰を吸引除去する。 37 ° C、5％CO 2培養液ごとに2日または3日を変更する。使用される培地は、細胞の生存にとって重要なスライス由来栄養因子を含んでいるので、それは、一度に培地の一部のみ（例えば½ボリューム）に置き換えるのがベストです。 </li></ol> 2。小脳スライスのFas処理と染色： <ol><li>アポトーシスチャレンジ実験のため、我々第一文化試験管 3（DIV3） で一日でメディアを変更する5日間のスライス。 DIV5文化にメディアの変化は文化のいくつかの死亡を誘発することができるので、細胞死のきれいな背景を持つためにメディアに直接追加することによって、Fas抗体のアゴニスト抗体のJo2のの0.5μg/ mLで扱われます。井戸の半分は、コントロールとして未処理のままされています。 </li><li> 24時間後に吸引でインサートの下にメディアを取り外します。スライスを修正するには、下に氷冷4％PFAを1mLとインサート上に1 mLを加える。室温で10分間インキュベートする。 </li><li> 10分後にPFAを削除し、冷PBSでサッと洗う。 </li><li>次のPBSを除去し、室温で5分間、PBSとインキュベートの20％氷冷メタノールのインサートの上に1mLの下に、1 mLを加える。 </li><li>再びPBSで洗浄し、下に1 mlを添加し、透過性のためのPBS中の0.5％のインサートトリトン- X - 100上記の1 mLを。 4℃で12時間の最小インキュベート℃に</li><li>透過した後、最小のためにPBSで20％BSAでブロックする4室の温度で時間または4℃で一晩この段階でスライスを4で少なくとも3日間℃でブロッキング溶液で保存することができます</li><li>スライスを染色するために、慎重に小脳スライスに接続されている挿入膜の一部をカットし、PBSを含む24ウェルプレートに移す。 </li><li>免疫染色は一晩1時間TUNEL試薬で最初にしてCalbidinの抗体を用いて、順番に行われます。 <ol><li> PBSを吸引除去し、各ウェルは、スライスの表面全体を確実に覆うことにTUNEL試薬から250μLを加える。暗所で一時間、37℃でインキュベートする。 </li><li>一時間はTUNELミックスを削除し、10分間PBSで3回洗浄した後。 </li><li>最後の洗浄後、PBSを除去し、PBSでカルビンジン抗体の1 / 1000希釈、250μLを追加し、4℃で一晩インキュベートします暗所で。 </li><li>一次抗体溶液を除去し、10分間PBSで3回洗浄する。 </li><li>暗所で室温で少なくとも3時間のためにPBSとインキュベートで1 / 500希釈した二次抗体250μLを加える。我々が使用TUNELキットはTMR赤で標識、従ってカルビンジンのための私たちの二次抗体はAlexa - 488に結合されるている。 </li><li> PBSで10分間3回洗浄し、DAPIを含むマウントメディアを使用してガラスの顕微鏡スライド上にスライスをマウントします。 </li><li>それぞれカルビンジンとTUNELのために488 nmの、561 nm励起wavelenghtを使用して共焦点顕微鏡と画像のスライスを。 </li></ol></li></ol> 3。代表的な結果： このプロトコルの主な課題は、私たちの最終的な読み出しが細胞死となる、特に以来、健康な小脳スライス培養を生成できるようにすることです。健全な文化は、細胞体層は半透明なものとして表示され、顕微鏡（図1）下小脳の葉状構造を見ることができます。文化の数日後のスライスが薄いと非神経細胞に開始するが、スライスのマージンからの移行を観察することができます。文化の数日後のスライスをカバー暗い円形の細胞は（おそらくマクロファージ）、最終的にin vitroで 10〜14日（図2）5の後で数に減少します。スライスの生存のための究極の証拠は、このようなプルキンエ細胞のためのカルビンジンなど、さまざまな細胞マーカー、のために染色することです。図3は、いくつかのTUNEL陽性の核とプルキンエ細胞層の代表的な共焦点顕微鏡画像を示しています。 いくつかのスライスは、アポトーシス刺激を受けた場合であっても、それらは唯一の24時間暴露されたことを考慮することが重要です。これは、TUNEL染色による死細胞のDNA断片化を観察するのに十分な時間を使用できますが、定義されたプルキンエ細胞層は依然として存在していた。 <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 DIV2で健康な小脳スライス。この画像半透明の細胞体層と健全なスライスの葉状小脳の構造を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 DIV 7の健康な小脳スライス。この画像では、我々はまだ小脳と暗い細胞体の外観の葉状構造を観察することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。 Fas抗体処理した小脳スライスの代表的なイメージが。この共焦点画像は、カルビンジン（緑）とTUNEL染色（赤）の陽性アポトーシス細胞で染色したプルキンエ細胞を示しています。プルキンエ細胞は、単一の行に表示されませんが、薄層のような構造を形成するクラスタ化されています。

<ol><li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+ependymal+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Human fetal ependymal cells in tissue cultures.</a> Anat Rec. 99, 523-529 (1947).</li>
<li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+studies+of+human+fetal+brain+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Etudes+Neonatales%22%5BJournal%5D)">Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures.</a> Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocol+for+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeat%2C+H+%22Organotypic+Slice+Cultures+of+Neural+Tissue+in+Culturing+Nerve+Cells%22">Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).</li>
</ol>

実施したすべての動物実験は、IACUCによって確立された方針に従って行われていた。ソーク研究所は、AAALAC認定施設です。

このメソッドは、神経器官の文化の多くの可能なアプリケーションの一つを説明し、それは、私たちは野生型と変異型脳切片におけるアポトーシス刺激の効果を検討することができました。 この実験の最も重要な部分は一貫して健康な小脳スライス培養を生成できるようにすることです。主な要因は、解剖やスライシング手法と可能な限り最短時間でプロトコルを実行する機能ですが、同時にスライスを傷つけないように気をつけながら。別の重大な要素は、培地の調製と組成物である、これらの文化は非常に敏感ですので、メディアのいくつかのレシピやブランドをテストしなければならなかった。血清またはメディアの他のコンポーネントのであっても別のバッチは、スライスの生存に影響を与える可能性があります。我々は、Invitrogenのロット＃480116からの馬の血清と最良の結果を得た。 小脳スライスが生成されると一小脳開発、電気生理学、単独でまたはアポトーシス刺激、興奮または酸素欠乏に応答して細胞の生存率を検討することができます。野生型と変異型小脳スライスを用いて比較研究は、小脳の機能と開発の多くの面で非常に洞察されている。

<table><tbody><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>瞬間接着剤</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6ウェル/24ウェル細胞培養プレート</td><td>Corning</td><td>3506/ 3527</td><td></td></tr><tr><td>30mm 培養プレートインサート (0.4-&amp;mu;m 孔径)</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>精製 NA/LE ハムスター抗マウス CD95 (Jo2)</td><td>BD Biosciences</td><td>554254</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In situ&lt;/em&gt; 細胞死検出キット, TMR red</td><td>Roche Group</td><td>12 156 792 910</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗 Calbindin D-28k 抗体</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-ヤギ抗ウサギ IgG 二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>DAPI含有 Vectashield封入剤</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

器官小脳文化：アポトーシス課題と検出

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

神経組織の器官型培養物は、1947年1,2でホギュが導入され、神経科学の分野で大きなブレークスルーを構成している。それ以来、技術は、器官培養を準備するために多くの異なる方法があるさらに、現在は開発されました。ここで紹介する方法はStoppini らによって記述される1つから翻案されました。スライスの準備のためとGogolla らから。染色手順3,4のために。 このテクニックのユニークな特徴は、すべての細胞組織と神経回路網が中断されているの解離の文化上の大きな利点を提供し、あなたが彼らの元の構造の海馬や小脳などの脳の異なる部分を勉強できることです。それは解離初代培養として取得するにはプルキンエ細胞の研究は、極めて困難なことができるので小脳の場合には、さらに有利である。このメソッドは、in vitroで小脳の特定の発達の特徴を学ぶだけでなく、野生型と変異マウスの両方における電気生理学的および薬理学的実験のために使用することができます。 方法は、アポトーシス細胞死を測定するTUNEL染色を用いて、このような発展途上小脳におけるFasリガンドとしてのアポトーシス刺激の効果を研究するために設計されてここで説明する。 TUNEL染色は、プルキンエ細胞のためのようなカルビンジンような細胞型特異的なマーカーと組み合わせている場合、それは細胞集団特異的に細胞死を評価することが可能である。カルビンジン染色はまた小脳の文化の質を評価の目的を果たします。

このメソッドは、器官小脳文化の世代と異なる小脳の細胞型の生存率に一定のアポトーシス刺激の効果を説明します。

神経組織のオルガノタイプ培養は、1947年にHogueによって初めて導入され1,2、神経科学の分野における大きなブレイクスルーとなった。...

本実験の目的は、野生型および変異型マウスの発達中の小脳における、アポトーシス誘導刺激であるfast ligandの影響を調査することである。まず、生後8日から12日の野生型マウスおよびノックアウトマウスの脳を解剖する。次に、脳を400 µmの厚さでスライスし、各スライスから小脳を分離する。第3のステップは、fast ligandで細胞死を誘導する前に、小脳スライスを5日間培養して健康な状態であることを確認することです。本手順の最終ステップは、アポトーシスマーカーであるTUNELの免疫蛍光染色と、プルキンエ細胞用のcalbindinなどの細胞型特異的マーカーを組み合わせて、野生型およびノックアウトマウスの異なる小脳細胞集団におけるfast ligandの効果を解析することです。小脳スライス培養の主な利点は、ニューロンネットワークや細胞組織が破壊される一次分散培養とは異なり、小脳の局在構造を維持できることです。したがって、本件は神経科学におけるいくつかの重要な疑問に答えることを可能にします。特に、野生型と変異型のマウスの両方を用いることで、比較発生学、生理学、さらに電気生理学や薬理学的な研究が可能となります。この手法は、小脳におけるfast ligandの機能や細胞生存への洞察を提供できるだけでなく、皮質や海馬におけるfast ligandの影響の調査にも利用できます。一般的に、この手法に不慣れな方は苦労することがあります。なぜなら、健全な小脳溶解物を得るためには、組織の完全性を損なうことなく、可能な限り迅速に培養に供することが極めて重要だからです。したがって、全工程を試みる前に、十分な解剖およびスライス技術を習得しておくことが重要です。可能な限りそうしてください。以下の手順の各ステップは、解剖前に組織培養フード内で行ってください。脳の解剖およびスライス作製用のA CSF培地と、スライス培養培地を記載されたプロトコルに従って調製し、解剖当日に4 °Cで保存してください。小脳スライスを培養するための組織培養プレートを用意してください。6ウェルプレートの各ウェルに、スライス培養培地を1 mLずつ加えます。次に、滅菌済みのピンセットを使用して、培養プレート用インサートを各ウェルに設置します。この際、インサートの下に気泡が溜まっていないことを確認してください。培地をプレコンディショニングするため、培養プレートを37 °C、5% carbon dioxideに設定した組織培養インキュベーターに少なくとも2時間置きます。次に、氷冷したCSF培地にcarbogenガスをバブリングします。培地をcarbogenで飽和させると、溶液のpHが変化し、色が赤からオレンジ色に変わります。氷冷し、バブリングしたA CSF培地を、滅菌済みペトリ皿と6ウェルプレートに少量ずつ注ぎます。これらを、脳のスライスに使用するバイブラトームのプレートと一緒に氷上に置きます。バブリングした氷冷A CSF培地を入れたペトリ皿は、解剖後のP8からP12のマウス幼若個体から脳を摘出する際に使用します。カミソリを用いて、片側の半球に矢状切断を加え、バイブレーションプレートに固定するための平坦な面を作成します。皮質の吻側端を切除しても構いません。冷却したバイブレーションプレートをペーパータオルで拭いて乾燥させます。次に、ステージに少量の瞬間接着剤を加え、チューブの先端でジグザグに広げます。薄い接着層を作るため、スパチュラを用いて脳をバイブレーターステージに移動させ、平らな面を瞬間接着剤に接触させます。脳をバイブレータープレートに固定したら、脳が浸る十分な量のA CSF培地を加え、プレートの下に氷を置いて冷却状態を維持します。脳を 400 µm の厚さのスライスに切断します。次に、先端を切り広げたプラスチック製のパスタピペットを使用し、解剖顕微鏡下で、氷上の A CSF 培地が入った 6 ウェルプレートにスライスを移します。小径の28ゲージ針を装着したインスリン用注射器2本を用いて、小脳を脳の他の部位から分離します。スライスの一部にシアノアクリレート系接着剤が付着している場合は、2本の注射針を使用してスライスから接着剤を除去してください。先端をカットして広げたプラスチック製パスタピペットを用い、スライスをフィルターの上へと移します。インサートあたり1〜3枚のスライスを加えることで、スライスが完全に広がり、液体に覆われていないことを確認します。必要に応じて、インキュベートされたピペットを用いて過剰な培地を吸引し、37 °C、5% carbon dioxide で48時間培養します。48時間後、培地容量の半分を新鮮な培地と交換し、インサートの下に気泡が溜まっていないことを確認してください。残りの元の培地には、細胞の生存に不可欠なスライス由来の栄養因子が含まれています。アポトーシス誘導刺激は、5日間の培養後に行います。処理するウェルの細胞培養培地に、速効性アゴニスト抗体JO2を添加します。ウェルの半分はコントロールとして未処理のままにします。24時間が経過したら、ウェルの下から培地を吸引します。次に、インサートの下に氷冷した4%パラホルムアルデヒドを1 mL、インサートの上にPFAを1 mLピペッティングして、スライスを固定します。切片をPFAで固定し、室温で10分間放置します。PFAを吸引し、冷PBS 2 mLを用いて短時間洗浄します。この際、ピペットでインサートの上に1 mL、インサートの下に1 mLを加えてください。次に、PBSを吸引し、インサートの下側に20% ice cold methanol in PBSを1 mL、インサートの上側に1 mLピペッティングします。室温で5分間インキュベートした後、ウェルから20% methanolを吸引し、スライスおよびDウェルをPBSで洗浄します。前述と同様に、インサートの上に0.5% Triton X 100 in PBSを1 mL、インサートの下側にさらに1 mLピペッティングします。透過処理後、切片を4°Cで最低12時間インキュベートし、透過させます。0.5% Triton X 100含有PBSを吸引し、切片の上に20% BSA含有PBSを1 mL、切片の下に1 mLピペッティングします。切片を室温で最低4時間、または4°Cで一晩ブロッキングします。ブロッキングが完了したら、清潔な鋏を用いて、小脳スライスに付着しているメンブレンインサートを慎重に切り出します。次に、清潔なピンセットを使用して、メンブレン片をPBSが入った24ウェルプレートに移します。PBSを吸引し、各ウェルに250 µLのTUNEL試薬を加えます。その際、試薬がスライス表面全体を覆っていることを確認してください。暗所で37°Cで1時間インキュベートし、1時間が経過したら、ウェルからトンネル試薬を吸引し、500 µLのPBSに置換します。プレートを遮光し、室温で10分間インキュベートして洗浄します。最後の洗浄後、この工程を2回繰り返します。PBSを吸引し、PBSで1:1000に希釈したcalbindin抗体 250 µLを加え、4 °Cで暗所にて一晩インキュベートします。翌日、一次抗体溶液を吸引し、PBSで10分間、3回洗浄します。次に、PBSで1:500に希釈した二次抗体を250 µL加えます。光から保護するためプレートをアルミホイルで覆い、室温で少なくとも3時間インキュベートします。切片をPBSで10分間、3回洗浄し、DAPIを含む封入剤を使用します。切片をガラス顕微鏡スライドとカバーガラスに封入します。共焦点顕微鏡を用い、CalbindinおよびTUNELに対してそれぞれ488 nanometerおよび561 nanometerの励起波長を使用して切片を撮影します。この画像は健康な小脳スライスを示しています。in vitroで2日後、細胞体層は半透明に見え、小脳の葉状構造が顕微鏡下で明確に観察されます。in vitroで7日後になっても、健康な小脳スライスの葉状構造は依然として確認できます。さらに、おそらくマクロファージと思われる暗い細胞体が通常スライスを覆っています。ここに示されている共焦点画像は、fast処理を施した小脳スライスを代表したものです。一次抗体で染色し、続いてAlexa 488結合二次抗体で染色した後、ビキニ細胞が緑色に現れます。使用したTUNELキットはTMRで標識されているため、TUNEL染色陽性の細胞死（アポトーシス）細胞は赤色に現れます。赤色のBikini細胞は一列に並ぶのではなく、クラスター状の構造を形成して現れます。この手順を行う際は、可能な限り組織培養フード内で作業し、大脳組織が細菌や真菌などの汚染物質にさらされる時間を最小限に抑えることが重要です。この手順を用いることで、これらのスライスに生化学的分析や電気生理学的分析などの他の手法を適用し、タンパク質含有量や神経興奮性に関する追加情報を得ることが可能です。この技術は、もともと、高速経路に影響を与える変異を持つPerkin細胞における、高速介在性細胞死の影響を研究するために開発されました。Perial細胞が初代培養で生存することは稀です。以上の手順が最善の実験的アプローチでした。このビデオをご覧いただくことで、大脳皮質スライス作製の方法、および刺激に対する反応とその異なる大脳細胞種への影響をどのように研究できるかについて、十分にご理解いただけたかと思います。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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