Name: 細胞死の正確な評価のために修飾されたアネキシンV /ヨウ化プロピジウムのアポトーシスアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 学ぶアネキシンV/PIアッセイの改良プロトコル。固定化とRNase A処理により細胞質RNA由来の偽陽性を排除し、細胞死評価の精度を向上させる。マクロファージなど多様な細胞系で適用可能。

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この研究は、カナダ自然科学（NSERC）研究助成金のエンジニアリング評議会とDRBにアルバータ州農業資金コンソーシアムの助成金によって支えられている。 AMRは、NSERCヴァニエカナダ大学院奨学金、アルバータ大学の授業助手職とクイーンエリザベスII大学院の奨学金によってサポートされています。

この手順は、500μLシリコナイズチューブまたは6 mLのポリスチレン丸底FACSチューブで行うことができます。他の手順と組み合わせて実行可能性分析を行う際に、後者は通常使用されます。与えられたすべてのボリュームは、6 mLのポリスチレン丸底FACSチューブ用です。 500μLシリコナイズチューブの場合は、1 / 5ですべてのボリュームを減らす。 フローサイトメトリー分析のための最適濃度は200μLボリューム2〜4 × 10 6個の細胞です。細胞の損失は、この手順からなることがありますので、我々は、各サンプルは、プロシージャの開始時に4 × 10 6個の細胞から構成されることをお勧めします。 1。細胞の準備<ol><li>収穫の細胞は - 対応する細胞株または初代細胞アイソレーションのための具体的な手順を参照してください。 </li><li> 10分間、335 × gでサンプルを遠心し、上清をデカントする。 </li><li> 2 mLの1 ×リン酸に再懸濁し細胞（PBS）緩衝生理食塩水- / - （無カルシウム、マグネシウムがない）。 </li><li> 10分間、335 × gでサンプルを遠心し、上清をデカントする。 </li><li> 1 mLの1 ×アネキシンV結合バッファーで細胞を懸濁します。 </li><li> 10分間、335 × gでサンプルを遠心し、上清をデカントする。 </li><li> 100μLの1 ×アネキシンV結合バッファーに再懸濁し細胞。 </li></ol> 2。アネキシンV / PIのアプリケーションでは、染色<ol><li>メーカーの推奨に従ってアネキシンVを追加する[例えば、5μLアネキシンVのAlexa Fluor ® 488（Molecular Probes社、A13201）]。 </li><li>室温で15分間暗所でチューブをインキュベートする。 </li><li>各反応チューブに1 ×アネキシンV結合バッファー100μLを加える。各チューブに約200μLがあるはずです。 </li><li> 1 ×アネキシンV結合バッファー（10μL1 ×アネキシンV結合バッファーを持つ、すなわち1μLPI）で1:10に希釈されたPIの4μL（Sigma、カタログ＃P - 4864 - 10ML）を追加します。これは、各サンプルに2μg/ mLの最終的なPIの濃度が得られます。 </li><li>室温で15分間暗所でチューブをインキュベートする。 </li><li>細胞を洗浄するために、500μLの1 ×アネキシンV結合バッファーを追加します。 </li><li> 10分間、335 × gでサンプルを遠心し、上清をデカントする。 </li><li> 500μL1 ×アネキシンVの結合緩衝液と1％のホルムアルデヒド（固定）ソリューションを作成するために500μLの2％ホルムアルデヒドで再懸濁し、細胞。穏やかなフリックでチューブを混ぜる。 </li><li>氷上で10分間サンプルを修正。また、サンプルは4℃で一晩保存することができます℃で暗所で。後者の方法が選択された場合、アネキシンV / PI（補償のコントロールを含む）で標識されたすべてのチューブ全体で一貫していることを確認します。 </li><li>各サンプルへとフリックにより穏やかに混合- / - 1 mLの1 × PBSを追加。 </li><li> 8分間425 × gでチューブを遠心し、上清をデカントする。 </li><li>手順2.10と2.11を繰り返します。 </li><li>チューブをフリックしてペレットを再懸濁します。 </li><li>濃度50μg/ mlの最終濃度になるように1:100希釈のRNase A（シグマ、R4642）の16μLを追加。 37℃で15分間インキュベート℃に</li><li> / - - 1 mLの1 × PBSを追加し、フリックにより穏やかに混合する。 </li><li> 8分間425 × gでチューブを遠心する。 </li><li>現在、サンプルを分析する準備が整いました。アネキシン/ PI染色は他の手続きと並行して実行されている場合、あるいは、試料は、その後の染色工程のために使用することができます。 </li></ol> 3。代表的な結果： 偽陽性のPI染色の度合いをした細胞タイプと細胞株の例を図1に示されています。偽陽性のイベントを考慮して、細胞を固定してから（図2B）RNase処理を受けていない細胞と比較して偽陽性のイベント、数の有意な減少でのRNase Aでこの結果を処理した。図2CはRNase処理を持たない細胞に比べて、RNase処理を受けた細胞の代表画像を示す。図3は、固定およびRNase処理のステップで変更されたアネキシンV / PIプロトコルは、偽陽性染色のイベントの数を制限することにより、従来のプロトコルを改良した方法を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。従来のヨウ化プロピジウム染色のプロトコルは、偽陽性のイベントのかなりの数につながる。我々は以前に動物モデルの広範なだけでなく、細胞株10の様々な主要な細胞間の偽陽性染色の程度を評価した。代表的な画像は、3つのユニークな細胞集団（ - RAWマクロファージおよびつの主要細胞 - マウス骨髄マクロファージ（BMM）と金魚の主腎マクロファージ（PKM）1つの一般的に使用される細胞株）における偽陽性染色の程度を示す。真陽性のイベントが核コンパートメント内でPIとDRAQ5の間に予想される共局在を（黄色の領域は、PIとDRAQ5の間で共局在を表す）が表示されます。 DRAQ5は非常に体肢です。NE透過性染料その生細胞と死細胞10,11,12の両方で正確に汚れ核コンパートメント。共局在DRAQ5汚れを簡単に視覚的な決定のための緑のpseudocolourを与えられた。 <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 PI核染色の精度を向上させる 。 （A）我々はDRAQ5に十分に特徴付けられた核染色（BrdUを、7 - AADとDAPI）の数の類似度に基づいて、PI核染色の精度を評価した。のBrdUは増殖細胞のDNAに組み込まれ、そのようにのみ核コンパートメント内に染色される合成ヌクレオシドである。 7 - AADは、PIと同様のDNAと、親和性の高い、無傷の原形質膜を越えることはできません。 DAPIは、DNAに強い親和性を有しており、蛍光顕微鏡で染色核の最も一般的に使用されています。類似度は正確にRAW 264.7マクロファージにおける細胞核を染色する能力を強調し、BrdUを、7 - AAD、DAPIとDRAQ5との間で&gt; 99％であった。対照的に、従来のプロトコルに基づいて細胞質PI染色はDRAQ5に相対的染色のパーセント類似性の著しい低下につながる。マウス骨髄マクロファージ（BMM）と金魚の主腎マクロファージ（PKM）：（B）も同様の結果が試験された2つの主要な細胞で観察される。染色手順内の特定の段階では50μg/ mlのRNaseの混入は非核兵器PI染色を削除し、大幅にDRAQ5染色の相対類似度を増加させる。 （C）一次性腎マクロファージの代表的な画像は、RNase処理がある場合とない場合のセルの類似度を示す。治療法の違いを簡単に視覚的判定のために、DRAQ5は緑色を与えられた。黄色の領域は、BrdUとDRAQ5、およびPIとDRAQ5の間で共局在を表しています。 <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。修正されたアネキシンV / PIは大幅に偽のアポトーシス/壊死性イベントを減少します。主な金魚の腎臓のマクロファージ（PKM）は、従来と変更されたアネキシンV / PIプロトコールで染色した。散布図はアネキシンV / PIは、金魚のPKM​​に染色描く。左の散布図は、PKM細胞の従来のアネキシンV / PI染色（無RNaseを）示しています。右上の散布図は、変更されたアネキシンV / PIプロトコル（RNaseの）で染色PKM細胞を示しています。偽陽性の汚れの除去に起因するPI染色の顕著な減少中のRNaseの結果の追加。 PKM細胞は、培養液、初期の前駆細胞（EP）、単球（モノ）と成熟し​​たマクロファージ（マットMAC）内の異なる個体群に基づいて分析した。偽陽性のイベントの除去に起因する正のPIのイベント数の減少は、より小さな早期の前駆細胞に比べて大規模な成熟したマクロファージ細胞においてより顕著である。従来のプロトコルに基づいて結論が誤って、より成熟したマクロファージサブセットの細胞死に正の相関を示唆しているでしょう。

<ol><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of apoptotic cell death.</a> J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).</li>
<li>Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V+expression+in+apoptotic+peripheral+blood+lymphocytes%3A+An+electron+microscopic+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation.</a> Apoptosis. 7, 41-47 (2002).</li>
<li>Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytofluorometric+analysis+of+cell+cycle+distributions+using+propidium+iodide.+Properties+of+the+method+and+mathematical+analysis+of+the+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data.</a> J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).</li>
<li>Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+of+Annexin+V-binding+apoptotic+cells+is+highly+fragmented%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented.</a> Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+apoptotic+cells+measured+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Features of apoptotic cells measured by flow cytometry.</a> Cytometry. 13, 795-808 (1992).</li>
<li>Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+death%2Flife+regulator+in+apoptosis+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis.</a> Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).</li>
<li>Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+and+necrotic+cell+death+induced+by+death+domain+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors.</a> Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).</li>
<li>Faleiro, L., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+disrupt+the+nuclear-cytoplasmic+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier.</a> J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).</li>
<li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+apoptosis+assays+using+propidium+iodide+generate+a+significant+number+of+false+positives+that+prevent+accurate+assessment+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death.</a> J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).</li>
<li>Edward, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+Use+of+DNA-specific+anthraquinone+dyes+to+directly+reveal+cytoplasmic+and+nuclear+boundaries+in+live+and+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells.</a> Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).</li>
<li>Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+of+the+DNA+targeting+bisalkylaminoanthraquinone+DRAQ5+in+intact+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells.</a> Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

アネキシンV / PIプロトコルは、従来のプロトコルの改良版であると考慮もPIに対して高い親和性を持つ細胞質のRNAの存在を取るここで紹介。染色手順の後半で1％ホルムアルデヒド固定ステップの後のRNase A（50μg/ mLの）の導入は、核PI染色の精度を大幅に向上します。負の効果は核PI染色や細胞膜アネキシンV染色で観察されていません。 RNase A処理することなく、PI染色結果の最大40％のカスタマーが、下流の結論10日に潜在的に有意かつ負の影響につながる偽陽性のイベントにつながる可能性があります。 、変更したアネキシンV / PI染色プロトコルは単純で、細胞の種類（ プライマリセルの広い範囲で効果的に使用されています：マウス骨髄マクロファージおよび脾細胞;豚肺常駐細胞、肺胞マクロファージ、腸間膜リンパ節の分離株、末梢血白血球、脾細胞、ニワトリ胚盤葉細胞を、金魚の主腎マクロファージ、コイ末梢血白血球、 細胞株 ：RAW 264.7マクロファージ、Jurkat T細胞、豚3D4/31マクロファージ、CCL - 71金魚のひれの繊維芽細胞、3B11ナマズのB細胞10）。細胞は差初代細胞は一般的に偽陽性のイベント10の大きい番号を持つとともに、偽陽性のPI染色によって影響されることに注意することは重要です。これらの細胞集団間の違いの偽陽性PI染色が部分的にセルサイズの違いに起因することがありますが、またRNAの含有量の違いから発生する可能性があります。この手順のような、組み込みは、他の人の間で利用する実験系、、遺伝毒性ストレスを受けた細胞は、細胞周期停止のようなチミジンやヒ​​ドロキシ尿素などの薬剤、ウイルス感染細胞、および発達進行胚細胞の研究で処理した細胞に特に関連として細胞のRNA合成における離散的な変化によって特徴付けられる。

<table><tbody><tr><td>1 x PBS-/-</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 x Annexin V結合バッファー</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>プロピジウムヨード (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>1 mg/mL in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>2% ホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1268</td><td></td></tr><tr><td>RNase A (ウシ膵臓由来)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50050</td><td>1 x PBS-/- で 1:60 に希釈</td></tr></tbody></table>

細胞死の正確な評価のために修飾されたアネキシンv /ヨウ化プロピジウムのアポトーシスアッセイ

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

細胞のアポトーシスの研究は著しく、フローサイトメトリーベースのメ​​ソッドの導入以来、影響されています。ヨウ化プロピジウム（PI）は広く細胞が原形質膜の完全性と透過性の1,2の違いによって、実行可能なアポトーシス、または壊死性かどうかを判断するためにアネキシンVと組み合わせて使用されます。アネキシンV / PIプロトコルでは、アポトーシス細胞3を研究するための一般的に使用されるアプローチです。それは細胞が4,5住んで染料を除外するその能力に基づいて、経済的安定と細胞生存率の良い指標であるため、PIは、より頻繁に他の核染色より使用されています。セルを入力するPIの能力は、膜の透過性に依存しています。PIは、無傷の原形質膜1,2,6の存在によるライブや早期のアポトーシス細胞を染色していません。後期アポトーシスとネクローシス細胞では、プラズマと核膜の完全性は、PIは、膜を通過する核酸にインターカレートし、赤色蛍光1,2,9を表示できるように、7,8を減少させます。残念ながら、我々は従来のアネキシンV / PIプロトコルが細胞質コンパートメント10内にRNAのPI染色に関連付けられている偽陽性のイベント（最大40％）のかなりの数、につながることがわかります。最高発生10を示す：（細胞質比が&lt;0.5核）初代培養細胞や動物モデルの広い範囲の細胞株は大型細胞で、影響を受けます。ここで、我々は、従来の方法に比べて細胞死の評価のための有意な改善を提供する修正アネキシンV / PI法を示しています。このプロトコルは、染色後の細胞に含まれるRNaseのエントリーを促進するための固定細胞中に細胞透過性の変化を利用しています。タイミングとRNaseの濃度の両方が細胞質RNAの除去に最適化されています。その結果、従来のアネキシンV / PIプロトコル（細胞質PI染色で&lt;5％のイベント）に比べて大きな改善です。

細胞死の評価のための正確な方法が記載されている。プロトコルは、細胞株および動物モデルの広い範囲からの一次細胞は40％、偽陽性のイベントを表示する従来のアネキシンV /ヨウ化プロピジウム（PI）のプロトコル、改良したものです。

細胞死の正確な評価のために修飾されたアネキシンV /ヨウ化プロピジウムのアポトーシスアッセイ

細胞アポトーシスの研究は、フローサイトメトリーを用いた手法の導入によって大きな影響を受けました。プロピジウムヨード（PI）は広く...

本実験の総合的な目的は、アポトーシスおよび／またはネクローシスによる細胞死を評価するための、従来のAnnexin Vおよびプロピジウムヨード染色法における現在の課題を克服することです。広範囲にわたる細胞株および初代細胞を用いた従来の染色アプローチでは、最大40%の偽陽性イベントが発生することが判明しました。これらの偽陽性イベントは、細胞質RNAの染色に起因しています。対照的に、本プロトコルでは、染色手順の特定の段階に固定およびRNA分解ステップを導入することで、偽陽性の発生頻度を大幅に減少させています。まず、従来の操作に従い、細胞死を検出するために細胞をAnnexin Vおよびプロピジウムヨードで染色します。次に、1% formaldehydeで細胞を固定し、血漿膜の透過性を高めます。最後に、固定した細胞をRNase Aで処理して細胞質RNAを分解し、偽陽性の原因となるプロピジウムヨード染色を排除します。多くの細胞生物学者と同様に、私たちはアポトーシスおよびネクローシスによる細胞死を検出するために、従来のAnnexin Vおよびプロピジウムヨードを用いたフローサイトメトリー法を使用してきました。しかしながら、最近、この方法ではさまざまな細胞株や初代細胞において、最大40%という相当数の偽陽性イベントが生じることが判明しました。本更新メソッドは、これらの問題点を克服するものです。本手法では、手順全体の特定のステップで細胞固定とRNA消化を行うことで、偽陽性イベントに直接つながる細胞質RNAを選択的に除去しています。実験で解析する細胞を回収します。本ビデオでは、生のマクロファージを使用します。例として、サンプルを4°Cで10分間、335 Gsで遠心分離し、上清をデカンテーションで除いた後、細胞を2 mLの1x PBSに再懸濁します。その後、同じ条件下で再度細胞を洗浄します。今回は、1 mLの1X NX-5結合バッファーで細胞を再懸濁します。サンプルを遠心分離し、上清を除去した後、最終的に100 µLの1X NX-5結合バッファーで細胞を再懸濁します。メーカーの推奨に従い、各細胞サンプルに Xin five を添加します。例えば、このビデオでは、各ポリスチレン製ラウンドボトムチューブに 2.5 µL の Xin five zi を添加しています。チューブを室温の暗所で 15 分間インキュベートします。次に、1X NX-5結合バッファーを100 µLずつ各反応チューブに加えます。これにより、各チューブ内の溶液量は約200 µLになります。続いて、1X NX-5結合バッファーを用いて、プロピジウムヨウ化物（PI）を1/10に希釈して調製します。希釈したPIを各チューブに4 µLずつ加え、各サンプルのPI最終濃度を2 µg/mLにします。チューブを室温の暗所でさらに15分間インキュベートします。このインキュベーション後、細胞を500 µLの1× NX and five binding bufferで洗浄し、サンプルを4°Cで10分間、335 ×gで遠心分離し、上清を捨てます。細胞をさらに500 µLの1× NX and five binding bufferと500 µLの2% formaldehydeに再懸濁します。1%ホルムアルデヒド溶液を作成するため、チューブを軽く弾いて混ぜ合わせます。固定後、サンプルを氷上で10分間固定します。各サンプルに1 mLの1x PBSを加え、軽く弾いて混ぜ合わせます。洗浄の間、4°Cで8分間、425 Gsで細胞を3回遠心分離します。1x PBSを用いてRNA Aを1/100に希釈して調製します。チューブを指で弾いてペレットを再懸濁し、最終濃度が50 µg/mLになるように、希釈したRNA A溶液を16 µL添加します。その後、サンプルを37 °Cで15分間インキュベートします。次に、1 mLの1x PBSで細胞を洗浄し、チューブを弾いて緩やかに混合した後、4 °Cで8分間、425 ×gで遠心分離します。これでサンプルの分析準備が整いました。また、N-X-M-P-I染色は他の手順と並行して実施されるため、その後の染色ステップにサンプルを使用することも可能です。代表的なイメージストリームフローサイトメーターの画像は、3つの異なる細胞集団における偽陽性染色の程度を示しています。一般的によく用いられるRAWマクロファージ細胞株1種と、骨髄マクロファージおよびキンギョ一次腎マクロファージを模した2種の一次細胞株を使用しました。キンギョ一次マクロファージの使用は、本手法が多様な細胞プラットフォームに適用可能であることを強調しています。真陽性イベントでは、核領域においてPIとdracの期待される共局在が示されます。PIは膜透過性の高い染料であり、黄色い染色によって、生存細胞および死細胞の核区画を正確に染色します。ここでは、PIによる核染色の正確性を、D dr five BRDU seven A.A D DPIおよびDRAC fiveとの類似度に基づいて評価しました。その結果、RAW 264.7マクロファージ細胞株において、核を正確に染色する能力に関して、DPIおよびDRAC fiveは99%以上の類似性を示しました。対照的に、従来のプロトコルを使用した際に生じる細胞質へのPI染色は、d dr fiveに対する核染色の類似度を著しく低下させました。この図から、50 µg/mLのRNase Aを添加することで非核のPI染色が除去され、金魚の骨髄マクロファージおよび一次腎臓マクロファージ細胞におけるd dr five染色との類似度が大幅に向上することがわかります。この図の一次腎臓マクロファージの代表的な画像では、RNase A処理により細胞質区分のRNA染色が消失していることが示されています。これらの金魚一次腎臓マクロファージの散布図は、修正後のnexin PIプロトコルで調製した細胞において、偽のアポトーシスまたはネクローシスイベントが有意に減少したことを示しています。新しいプロトコルでは、84.9%の細胞が生存していることが示されています。ゲートは、蛍光特性および形態学的特性を評価するパラレルイメージストリームサンプルに基づいて設定されました。ある例において、初期前駆細胞である単球および成熟マクロファージを、本ビデオで説明する改良版NX in five PIプロトコル、または本図の従来法を用いて染色しました。改良プロトコルで染色した細胞では、RNase処理により偽陽性イベントが除去されたため、PI陽性イベント数が視覚的に減少していることがわかります。さらに、この効果は、小型の初期前駆細胞よりも、大型の成熟マクロファージ細胞においてより顕著に現れました。従来のプロトコルに基づいた結論では、より成熟したマクロファージサブセットにおいて細胞死に正の相関があるという誤った示唆がなされていた可能性があります。この染色手順の後、細胞分離物内のサブポピュレーションに関する特定の疑問を解決するために、細胞内染色や表面染色などのさらなるステップを行うことができます。この手法の有用性は免疫学的な疑問に留まらず、例えば、遺伝毒性ストレスを受けている細胞、細胞周期停止剤（チミジンやヒドロキシウレアなどの薬剤）で処理された細胞を利用する実験系や、発生の進行が細胞RNA合成の不連続な変化によって特徴付けられる胚細胞の研究にも適用可能です。

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生物学

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腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼCアイソザイム

このビデオでは、蛍光アネキシンV染色を使用して、赤血球プログラム細胞死である紅葉症の程度を測定するアネキシンV結合アッセイを実演します。アポトーシス赤血球は、細胞膜の内側から外側のリーフレットへのホスファチジルセリン転座を示し、フルオロフォアタグ付きアネキシンVが転座したホスファチジルセリンに結合し、それによって蛍光シグナルを放出します。...

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治療用化合物は、多くの場合、最初の生存率アッセイとin vitroで調べられます。人間の観察者によってブラインド細胞数は、細胞数の小さな変化に非常に敏感であることができますが、機能を評価しないでください。コンピュータ化された生存率アッセイは、ここで説明するように、客観的に構造および機能の両方を評価することができる。...

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マルチプレックスアッセイは、基本的な細胞メカニズムのための有益な情報を提供し、試薬および不必要な反復実験の無駄をなくすことができます。我々は、パルミチン酸との酸化的チャレンジ後のin vitroモデルの視床下部での細胞生存率を決定するために、蛍光及び発光に基づく方法を用いて、ここに多重化カスパーゼ3/7活性アッセイを記載する。...

視床下部細胞モデルでアポトーシスを決定するために、カスパーゼの多重化アッセイの使用

アナスタシスという用語は、死にかけている細胞が細胞の自殺プロセスを後期段階で逆転させ、自分自身を修復し、最終的に生き残る現象を指します。ここでは、アナスタシスを受ける細胞を検出および追跡するためのプロトコルを示します。...

トラッキングアナスタシス、アポトーシスを逆に細胞生存現象のための戦略

検出、定量化およびアポトーシス サンプルから高純度にアポトーシス小体を分離する流れの cytometry...

高純度にアポトーシス小体の検出と分離

このプロトコルは、細胞の生存率を効率的に決定するための、高速で高スループット、信頼性、安価、および公平なアッセイを記述します。このアッセイは、細胞のミトコンドリアが損傷し、他のアッセイに干渉する場合に特に有用である。このアッセイは、Hoechst...

マイトカン細胞毒性の正確な決定のための自動差動核染色アッセイ

アポトーシスは、初期および後期のアポトーシスバイオマーカーのフローサイトメトリー分析によって特徴付けることができます。子宮頸がん細胞株SiHaを、卓上フローサイトメーターを用いてアクチノマイシンDで処理した後のアポトーシスバイオマーカーについて分析した。...

アクチノマイシンD処理SiHa子宮頸癌細胞におけるアポトーシスバイオマーカーのフローサイトメトリー解析

このプロトコルは、PMA 分化型 THP-1 マクロファージの LPS および ATP...

PMA分化型THP-1マクロファージのLPSおよびATP誘発死とその検証

パイロシーケンシングでは、（R）多型を解析するために使用される、これまでで最も徹底的なシンプルな方法のひとつです。このメソッドは、多くの臨床的に関連する遺伝子多型を含めて迅速かつ効率的な一塩基多型の評価につながっている。パイロシークエンスの手法と方法論が説明されています。...

パイロシーケンシング：正確なジェノタイピングのための簡単​​な方法

学ぶアネキシンV/PIアッセイの改良プロトコル。固定化とRNase A処理により細胞質RNA由来の偽陽性を排除し、細胞死評価の精度を向上させる。マクロファージなど多様な細胞系で適用可能。

細胞死の正確な評価のために修飾されたアネキシンV /ヨウ化プロピジウムのアポトーシスアッセイ

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