細胞死の正確な評価のために修飾されたアネキシンV /ヨウ化プロピジウムのアポトーシスアッセイ

この実験の全体的な目標は、アポトーシスおよび/またはネクローシスによる細胞死の評価のための従来のアネキシン5およびヨウ化プロピジウム染色技術の現在の問題を克服することです。私たちは、広範囲の細胞株および初代細胞の従来の染色アプローチにより、最大40%の偽陽性イベントが発生することを発見しました。これらの偽陽性事象は、細胞質RNAの染色によるものです。

逆に、私たちのプロトコルは、特定の段階で固定とRNA分解ステップを導入することにより、偽陽性の発生率を大幅に減らします 染色手順では、最初に細胞をX in 5とヨウ化ペリジウムで染色して、従来の手順に従って細胞死を検出します。次に、細胞を1%ホルムアルデヒドで固定し、これにより原形質膜の透過性を高めます。最後に、固定細胞をRNA Aで処理して細胞質RNAを分解し、ヨウ化プロピジウム染色の原因となる偽陽性を排除します。

多くの細胞生物学者と同様に、私たちは従来のネキシンファイブおよびヨウ化プロピジウムフローサイトメトリー法を使用して、アポトーシスおよび壊死細胞死を検出してきました。残念ながら、最近、この方法では、さまざまな細胞株や初代細胞で最大40%の偽陽性イベントが大量に発生することがわかりました。この更新された方法は、これらの欠点を克服します。

私たちのアプローチは、手順全体の特定のステップで細胞固定とRNA消化を利用して、cyopプラスミックRNAを選択的に除去し、これらの偽陽性イベントに直接つながる染色、実験のために分析する細胞を収穫します。このビデオでは、生のマクロファージを使用しています。例として、サンプルを335Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、上清をデカントし、細胞を1つのXPBSの2ミリリットルに再懸濁します。

次に、同じ条件下で細胞を再度洗浄します。今回は、X NX1個と結合バッファー5個を1ミリリットルに細胞を懸濁させました。サンプルを遠心分離し、上清を再度デカントした後、最終容量の100マイクロリットルのone X NX Xin five結合バッファーに細胞を再懸濁します。

各細胞サンプルにXin fiveをメーカーの推奨に従って添加します。たとえば、このビデオでは、2.5マイクロリットルのXin five ziが各ポリスチレン丸底チューブに追加されています。チューブを暗所で室温で15分間インキュベートします。

次に、5つの結合バッファーに100マイクロリットルのX NXを各反応チューブに加えます。これで、各チューブに約200マイクロリットルの溶液が入っているはずです。次に、1つのX NX.In 5結合緩衝液に1〜10希釈のプロピジウム、ヨウ化物、またはPIを調製し、希釈したPIを各チューブに4マイクロリットル加えると、各サンプル中に1ミリリットルpiあたり2マイクログラムの最終濃度が得られます。

チューブを再び暗所で室温で15分間インキュベートします。このインキュベーション期間の後、500マイクロリットルの1つのxおよびxおよび5つの結合バッファーで細胞を洗浄し、サンプルを335Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、スナットをデカントします。細胞を1つのX NXと500マイクロリットルの2%ホルムアルデヒドを含む5つの結合バッファーの別の500マイクロリットルに懸濁します。

1%ホルムアルデヒド溶液を生成するには、チューブを穏やかにフリックして混合します。サンプルを固定後10分間氷上に固定します。各サンプルに1ミリリットルのXPBSを添加し、洗浄中に4°Cで8分間、摂氏4度で3回、細胞を遠心分離機でフリックして穏やかに混合します。

1つのXPBS中にRNA Aの1〜100希釈液を調製し、チューブをフリックしてペレットを再懸濁し、希釈したRNAを16マイクロリットル加え、最終濃度50マイクログラム/ミリリットルを得るための溶液。次に、サンプルを摂氏37度で15分間インキュベートします。次に、1ミリリットルのXPBSで細胞を洗浄し、フリックして穏やかに混合し、チューブを425GSで摂氏4度で8分間遠心分離します。

これで、サンプルを分析する準備が整いました。あるいは、N-X-M-P-I染色が他の手順と並行して行われている場合は、サンプルを後続の染色ステップに使用することができます。代表的な画像ストリームフローサイトメーターの画像は、3つのユニークな細胞集団における偽陽性染色の程度を示しています。

一般的に使用される1つの細胞株生マクロファージと、骨髄マクロファージと金魚の初代腎臓マクロファージを反映した2つの初代細胞株。金魚の一次マクロファージの使用は、さまざまな細胞プラットフォームにわたるこの技術の適用性を強調しています。真陽性イベントは、PIとdracの間の核コンパートメント内で予想される共局在を示します。

第五に、黄色の染色によって証明されるように、生きている細胞と死んだ細胞の核コンパートメントを正確に染色する高膜透過性色素。ここでは、PI核染色の精度を、D dr 5、BRDU 7、A.A.D DPI、およびDRAC 5との類似度に基づいて評価しました。また、DRAC 5は、生の2 64 0.7マクロファージ細胞株の核を正確に染色する能力において99%を超える類似性を示しました。対照的に、従来のプロトコルを使用した場合に発生する細胞質PI染色は、d dr fiveと比較して核染色の類似性が著しく減少しました。

この図では、50マイクログラム/ミリリットルのRNAsAを取り込むと、非核PI染色が除去され、murn、骨髄マクロファージ、および金魚の初代腎臓マクロファージ細胞におけるd dr five染色と比較して類似性の程度が大幅に増加することがわかります。この図の初代腎臓マクロファージの代表的な画像は、RN aの治療により細胞質コンパートメントでのRNA染色が失われていることを示しています。これらの初代金魚腎臓マクロファージの散布図は、改変されたネキシンPIプロトコルで調製された細胞における偽のアポトーシス壊死イベントの有意な減少を示しています。

新しいプロトコルでは、84.9%の細胞が生存可能であることが示されています。ゲートは、蛍光および形態学的特徴を評価する平行画像ストリームサンプルに基づいて描画されました。一例では、このビデオに記載されている5つのPIプロトコールで、初期前駆細胞の単球および成熟マクロファージを改変NXにより染色した、または、この図の従来の方法により、改変プロトコールにより染色された細胞は、RNA処理による偽陽性イベントの除去により、陽性PIイベントの数が視覚的に減少したことを示した。

さらに、この影響は、小さな初期の前駆細胞よりも大きな成熟マクロファージ細胞でより顕著でした。従来のプロトコルに基づく結論は、誤って、より成熟したマクロファージサブセットの細胞死に正の相関関係を示唆していたでしょう この染色手順に続いて、細胞内染色または表面染色などのさらなるステップを実行して、細胞分離内の亜集団に関する特定の質問に答えることができます。この手法の関連性は、免疫に基づく問題にとどまらず、例えば、細胞周期停止で処理された遺伝毒性ストレス細胞、チミジンやヒドロキシ尿素などの薬剤を利用する実験系や、発生進行が細胞RNA合成の離散的な変化によって特徴付けられる胚細胞の研究にも関連しています。